一種高產橙皮苷酶的黑曲霉kh005及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及微生物領域，具體設及一種高產澄皮巧酶的黑曲霉K冊05及其應用。
【背景技術】
[0002] 澄皮巧酶是水解澄皮巧關鍵酶，具有很高的應用價值。利用澄皮巧酶水解澄皮巧 可W得到澄皮素單糖巧、澄皮素、鼠李糖和葡萄糖。此外將澄皮巧酶添加到枯瓣罐頭中，水 解其中的澄皮巧，可W防止相枯罐頭產生白色沉淀。
[0003] 澄皮巧酶可由多種微生物產生，如青霉菌、米曲霉、黑曲霉和擬桿菌屬等。目前國 內關于產澄皮巧酶菌株的研究還比較少，已有報道的產澄皮巧酶的菌株多為霉菌。
[0004] 目前，在國內澄皮巧酶的研究基本都停留在實驗室階段，還不能夠進行工業生產； 商品酶制劑主要依賴進口，價格也比較昂貴（1200元/kgW上）。采用現有的菌株生產澄皮巧 酶成本比較高，很難達到工業化生產的要求。已有報道的菌株產酶效率均不高，培養時間一 般都在5-7天;且酶的熱穩定性較差，當在大于45°C的水浴中處理30min左右，酶活便出現了 明顯的下降。因此，篩選出產酶效率高，且酶熱穩定好的菌株是澄皮巧酶能夠工業化應用關 鍵。
【發明內容】
[0005] 本發明目的在于提供一種高產澄皮巧酶的黑曲霉KH005,解決現有菌株生產澄皮 巧酶的效率低、生產的澄皮巧酶的熱穩定性差的問題，降低澄皮巧酶的生產成本，W實現工 業化生產。
[0006] 此外，本發明還提供黑曲霉K冊05的應用。
[0007] 本發明通過下述技術方案實現：
[000引一種高產澄皮巧酶的黑曲霉K冊05,所述黑曲霉K冊05保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中屯、，保藏名稱為K冊05,其保藏號為:CGMCC12101。
[0009] 本發明中設及保藏的黑曲霉K冊05的保藏信息如下:保藏單位：中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中屯、;地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物 研究所;保藏日期：2016年1月25日；保藏編號：CGMCC12101，保藏名稱為K朋05 ;分類命名： Aspergillus niger。
[0010] Κ冊05菌株的鑒定：
[0011] 1)、DNA 提取：
[0012] 收集菌體，溶于5血提取緩沖液（lOOmMTris · CiaOOmM化遜)TA，200mM化Cl，2% CTAB，p 服.0)中，37°C振蕩 45min。加入 0.75mL 20%SDS，65°C水浴化。12,000rpm，離屯、 lOmin，收集上清。上清用等體積的酪:氯仿:異戊醇（25:24:1)抽提2次，加入終濃度0.3M的 NaAC(抑5.2)及2倍體積的無水乙醇，室溫沉淀化。4 °C，12，00化pm，離屯、20min，收集沉淀，用 70%乙醇漂洗2次，驚干后溶于50μΙ TE( lOmmTris-Hcl，ImmNas抓TA)中，即得總DNA。
[001引 2)、擴增ITS序列：
[0014] w上述總DNA為模板，真菌通用引物口S1(SEQ IDNo.2:TCCGTAGGTGAACC TGCGG)和 ITS4(SEQ ID No. 3:TCCTCCGCTTATTGATATGC)分別為正向引物和反向引物擴增ITS序列。擴 增反應體系為50化：10 X Buf f er扣L，dNTP 1化，Taq酶0.扣L( 2U)，正反向引物各化L，模板 DNA lyL，ddH20 40.扣L。擴增反應條件：94°C4min 預變性；94°C0.5min，55°Clmin，72°C 0.5min，30 個循環；72°C 延伸 7min。
[001引 3)、ITS序列分析：
[0016]將擴增的ITS片段送上海生工測序，擴增片段測序結果SEQ ID No. 1所示;通過美 國國家生物技術信息中屯、的BLAST捜索程序進行比較獲得同源性分析結果如表1所示： [0017]表1擴增片段的同源性比對分析 [001 引
[0019] 進一步地，黑曲霉KH005是W積實為原料，在培養基中經過初篩選挑選出產澄皮巧 酶能力強的菌株，將初篩選出的菌株在培養基中經過多次轉接篩選獲得。
[0020] 所述積實原料通過市場購買獲得。
[0021] 進一步地，培養基的成分為:2.0g硝酸鋼、0.05g氯化鐘、l.Og憐酸二氨鐘、18.0g澄 皮巧、20. g瓊脂和1L蒸饋水。
[0022] 進一步地，培養基的初始pH值為6.0-6.5。
[0023] 黑曲霉K冊05的篩選過程：
[0024] 1)、培養基的制備:將2. Og硝酸鋼、0.05g氯化鐘、l.Og憐酸二氨鐘、18.Og澄皮巧、 20. g瓊脂溶解與1L蒸饋水中，并用1M的鹽酸調抑為6.0-6.5，分裝Ξ角瓶，121°C滅菌15min， 待培養基冷至50-55 °C時，倒平板，冷卻后備用。
[0025] 2)、菌株的初篩:無菌條件下取20克積實于裝有200mL無菌水Ξ角瓶中，置揺床上 室溫振蕩30分鐘。取菌液按10倍的梯度稀釋到ΙΟΛ取各稀釋度菌液ImL放入無菌平皿中，倒 入滅菌后冷卻至50°C的培養基，混勻，待凝固后放入30°C培養箱培養5天，觀察菌落周圍透 明圈的大小進行初篩，挑取有透明圈的菌株保經進一步純化后保存到斜面培養基;然后將 純化后的菌株接種到平板培養基上培養5天，測量透明圈的直徑，結果如表2所示。因為澄皮 巧酶分解澄皮巧產生在菌落周圍形成透明圈，所W通過透明圈的大小可W初步判斷菌株產 澄皮巧酶能力的大小。挑選菌落周圍有透明圈的單菌落保存。初篩得到的菌株經形態觀察 發現均為霉菌。
[0026] 表2初篩得到菌株的菌落形態及透明圈直徑
[0027]
[002引 3)、菌株的復篩：
[0029] 將初篩的菌株經過多次轉接后發現，大部數菌株菌落生長逐漸變得緩慢，形成的 透明圈也越來越小。經過多代篩選，最終獲得了一株生長迅速、色素少且產澄皮巧酶能力穩 定的菌株K冊05,根據形態初步鑒定為霉菌。
[0030] 進一步地，黑曲霉K朋05的菌落特征如下：所述黑曲霉的菌落在PDA培養基上福射 生長，30°C培養3天直徑為30-40mm;初為白色，后變成黑色厚絨狀，周圍有白色的暈圈，菌落 背面呈淺褐（菌落形態圖如圖1所示）；其分生抱子頭呈球形，小分生抱子頭呈疏松柱形排 列；分生抱子梗直接生于基質或生于氣生菌絲，分生抱子梗為球形或近球形，呈褐色，抱子 表面平滑。
[0031] 將4°C保存的菌株用PDA斜面培養基活化3天，然后用接種針挑取斜面的菌落接種 到PDA平板培養基上，于30°C培養3天，觀察菌落形態，于顯微鏡下觀察分生抱子及分身抱子 梗的形態（如圖2所示）。用掃描電鏡Quanta?450FEG觀察菌體的超微結構（如圖3和圖4)所 /J、- 〇
[0032] 一種高產澄皮巧酶的黑曲霉K冊05的應用，黑曲霉K冊05用于生產澄皮巧酶。
[0033] 將KH005菌株接種到發酵培養基中，發酵培養基的組分如表3所示，在30~35°C條 件下，150~2(K)rpm，發酵培養6~8天;然后過濾，去掉菌體殘渣，收集得到粗酶液，4°C冷藏 保存備用。
[0034] 表3發酵培養基組分
[0035]
[0036] ~試驗證明，本發明所述KH005菌株與現有菌株相比生產澄皮巧酶的效率高(例如已' 經公告的申請號為200610051963. X的發明專利，其采用液態培養時，澄皮巧酶的酶活為 14000U/g，采用固態培養時，澄皮巧酶的酶活為6000U/g;且原料的投入量較大，不利于工業 化生產），且生產的澄皮巧酶的熱穩定性好，原料的投入量少，更容易實現工業化生產，產澄 皮巧酶的效率通過測定上述粗酶液中澄皮巧酶活性得知，具體測定過程如下：
[0037] 試管中加入5ml pH4.5的醋酸-醋酸鋼緩沖液、4.5ml濃度為0.2%的澄皮巧底物溶 液，在45 °C水浴下保溫5min，然后加入0.5ml上述粗酶液，充分搖勻，準確計時，45 °C反應 20min，再迅速移入沸水浴中滅活lOmin，采用高效液相色譜法測得剩余底物量，得出底物減 少量，從而測出酶活。
[0038] 計算公式如下：
[0039] 粗酶液的酶活力化/ml) = (b-a)/(20X0.5);其中，a(μg)為酶解后剩余底物含量； b(yg)為反應前的底物含量。
[0040] 測定結果表明該粗酶液澄皮巧酶活性為2218U-2548U。
[0041 ]對于酶活的計算方式主要包括兩種:一種是按照液體體積計算U/ml;另一種是按 照所投原料的質量計算U/g，本發明所述的酶活經過優化后3-4天酶活(按照液體體積計算 U/ml)便可W達到2000UW上，如果按照所投原料的質量計算，我們的菌株酶活可W達到 80000U/gW 上。
[0042] 本發明采用的培養基與已公告專利200610051963.X的培養基不同，投入原料的質 量比較少，經過換算實際我們投入原料的質量不到已公告專利所投料的1/7。我們在實際的 生產中發現，投料太多，液態發酵的時候培養基會很粘稠，容易導致滅菌不徹底，且產生大 量的氣泡影響通氣，反而不利于微生物的發酵產酶。我們的菌株在投料量比較少的情況下， 可W獲得比較好的產酶效果，更容易實現工業生產。
[0043] 澄皮巧酶的酶活定義:在45°C、pH4.5的條件下，每分鐘轉化1微克澄皮巧底物所需 的酶量為一個酶活力單位化)。
[0044] 酶活的定義不同文章或者專利有一定的差異，但是我們酶活的定義采用的是目前 比較公認的一種定義。可W參見文獻（申麗靜，汪創.澄皮巧酶的制備及其催化性質的研究 [D].浙江工業大學，2006 : 63 ;孟娜，魏勝華，鄭長龍.黑曲霉發酵產澄皮巧酶的工藝優化 [J].生物技術，2011,21(2): 77-80)。
[0045] 并且，對制備的粗酶液中的澄皮巧酶的熱穩定性進行測定：
[0046] 通過將澄皮巧酶置于一定溫度下進行培養，每隔一段時間測量澄皮巧酶的酶活， W最初的澄皮巧酶的酶活進行比較來判斷澄皮巧酶的熱穩定性，申請人通過實驗證明：通 過本發明所述的黑曲霉K冊05生產的澄皮巧酶的熱穩定性好:在50-55°C條件下反應7化后， 酶活可W保存50 %左右;在60-65 °C條件下反應24h酶活依然可W保存50 %左右，即在50-55 °C條件下，酶的半衰期為72h，在60-65°C條件下半衰期為24h，