一種阿特拉津降解菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種菌株，尤其是設及一種阿特拉津降解菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 據估計全球每年有1250萬噸的農藥活性成分被用于農業生產，其中除草劑的使用 量最大，占農藥使用量的40 %左右。阿特拉津(2-氯4-2異丙氨基-6-乙氨基-S-S嗦)與S嗦 除草劑西瑪津、特下津和撲滅津具有相同的活性結構，作為使用量最大的=嗦類除草劑被 廣泛地用于玉米、高梁等作物的農業生產中來控制出苗前后一年生禾本科和闊葉雜草。阿 特拉津進入環境主要是由于使用不當，控制雜草和后續的地表徑流進入地表水滲入或通過 ±壤進入地下水。阿特拉津在±壤環境中的行為設及到幾個不同的過程，包括化學、生物和 光化學降解、運輸、積累和吸附。阿特拉津的傳輸發生通過擴散、質量流量，甚至被吸附到載 體物質如溶解的有機物質或±壤膠體。吸附到固定相如粘±礦物或±壤有機質使除草劑在 ±壤圈，導致在±壤中積累和污染。盡管在90年代禁止，莽去津仍然可W在歐洲環境樣品中 檢測出，在多年的使用后阿特拉津及其代謝物的遷移滲濾，導致全球范圍內地下水污染和 ±壤污染。在中國阿特拉津曾經被大量生產和使用，導致阿特拉津及其代謝產物廣泛存在 于±壤環境和自然水體中。阿特拉津作為一種環境內分泌干擾物，其毒性受到廣泛的關注， 研究表明阿特拉津及其代謝產物具有發育生殖毒性、遺傳毒性、免疫毒性、神經毒性、致癌 性等。阿特拉津在±壤和水體的污染導致食品與飲用水安全問題。對于農藥的面源污染，由 于其污染范圍廣，污染面積大，其他方法治理的難度大，成本高不易實施。因此阿特拉津環 境污染的生物修復是一種有效的治理手段，其中微生物修復方法因為其成本低，操作簡單 可W在環境中大面積應用而受到關注，其中阿特拉津高效降解菌的選育成為關鍵。
[0003] 中國專利CN 102492637 A公布了一株阿特拉津降解菌，它設及一株降解菌。它為 不動桿菌(Acinetobacter SP. )DNS32，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 屯、保藏，保藏編號為CGMCC NO.5365,保藏日期為2011年10月21日。菌株DNS32,具有高效降 解阿特拉津的能力，36小時降解率可達95.88%;菌株DNS32的最適溫度范圍為25-3(rC，比 已報道菌株低5-10°C;菌株DNS32對鹽分的耐受能力較強，鹽度為1-4%條件下36小時降解 率均高于60%，優于已報道的其它同功能菌株，適用于高鹽分環境阿特拉津污染的修復。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種阿特拉津降解 菌及其應用。
[0005] 本發明的目的可W通過W下技術方案來實現：
[0006] 一種阿特拉津降解菌，降解菌名稱為CX-T，屬于劍菌屬化nsifer SP.)，其在中國 典型培養物保藏中屯、保藏，保藏單位地址：中國，武漢，武漢大學，其保藏編號是:CCTCC No: M2015741，保藏日期為2015年12月14日。
[0007] 所述的阿特拉津降解菌為革蘭氏陰性、接觸酶陽性、氧化酶陽性菌。所述的阿特拉 津降解菌為好氧菌，應在有氧條件下使用。
[000引該降解菌包含阿特拉津的降解基因 atzA、atz B、atz C及atz D，分別編碼阿特拉 津降解酶AtzA、Atz B、Atz C、Atz D。降解途徑為atz A-atz B-atz C-atz D，中間代謝產物 分別為?基阿特拉津化y化o巧atrazine)，脫乙基阿特拉津(N-Isop;ropylammelide)，氯尿 酸（切anurica Acid)，雙縮脈(Biuret)。對阿特拉津降解完全，可W有效的對阿特拉津脫 O
[0009] 降解基因 atzA的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示，降解基因 atz B的堿基序列如SEQ ID NO.2所示，降解基因 atz C的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，降解基因 atz D的堿基序列 如沈Q ID NO.4所示。
[0010] 所述阿特拉津降解菌可W通過細胞分裂方式進行快速繁殖，10小時內可W形成穩 定的菌落，對于濃度lOOmg/L的阿特拉津可W在45h內完全降解，具有很高的降解效率，有很 好的工程應用潛力和應用前景。
[0011] 所述的阿特拉津降解菌用于受阿特拉津污染的±壤表層和自然水體表層的生物 修復。所述的阿特拉津降解菌在受阿特拉津污染的±壤或水體中可W迅速繁殖，并^±壤 或水體中的阿特拉津為唯一氮源，利用所含降解基因 atz A、atz B、atz C、atz D編碼轉錄 的降解酶atz A、Atz B、Atz C、Atz明尋阿特拉津降解代謝，達到±壤和水體污染的生物修 復目的，其降解阿特拉津進行污染±壤的生態修復功能通過降解基因表達相應的生物酶進 行一系列生物反應完成。該菌株對阿特拉津污染具有高耐受濃度(大于lOOmg/L)和高的降 解效率，對于阿特拉津污染的±壤和水體具有有效的治理能力。菌株的使用可W有效的改 善和恢復±壤和水體生態環境，具有良好的應用前景。
[0012] 采用投加阿特拉津降解菌種在±壤或水體環境中通過細胞分裂方式進行增殖。
[0013] 所述的阿特拉津降解菌種為干粉狀或菌懸液狀態。
[0014] 所述的阿特拉津降解菌使用時，最佳降解溫度范圍為25-35°C，最佳降解環境的抑 范圍為5-9，能夠很好的適應自然環境。
[0015] 本發明通過用阿特拉津定向馴化受阿特拉津污染±壤中的細菌，通過長期選擇培 養，篩選出一種阿特拉津的高效降解菌巧nsifer SP.)，通過分子生物學方法鑒定其降解基 因為atz A、atz B、atz C、atzD，研究其降解途徑為atz A-atz B-atz C-atz D，可W將阿特 拉津降解脫毒。初步的±壤降解實驗表明該菌株可W在溫度25-35°C范圍內在45h內將濃度 為lOOmg/L的阿特拉津完全降解。通過該菌株在污染±壤中的施用可W有效的達到治理阿 特拉津污染的目，具有廣闊的應用前景和良好的環境效益。
[0016] 與現有技術相比，本發明具有W下優點及有益效果：
[0017] 1、本發明的菌株化nsifer SP.)具有良好的對阿特拉津降解特性，其降解特性用 于受阿特拉津污染的±壤和水體的生物修復用途。可W在常溫正常pH值條件下將阿特拉津 高效降解，達到阿特拉津脫毒修復污染±壤的目的。
[0018] 2、本發明的菌株化nsifer SP.)為±壤中馴化選育的物質，作為工程菌投加到± 壤中不會受到±著細菌的排斥，可W快速的繁殖增長實現降解阿特拉津治理±壤污染的目 的。
[0019] 3、本發明的菌株巧nsifer SP.)最佳降解溫度為25-35°C，最佳抑為5-9,可W很好 地適應自然條件下的工程應用。
[0020] 4、本發明的菌株化nsifer sp .)包含阿特拉津降解基因 atz A、atz B、atz C、 atzD，可W編碼降解過程的四種酶，對阿特拉津的脫毒降解更加徹底。
[0021] 5、本發明的菌株可W通過細胞分裂方式進行快速繁殖10小時內可W形成穩定的 菌落，對于濃度lOOmg/L的阿特拉津可W再45h內完全降解，具有很高的降解效率，有很好的 工程應用潛力和應用前景。
【附圖說明】
[0022] 圖1為阿特拉津降解菌16S rRNA基因的PCR擴增圖譜；
[0023] 圖2為基于16S rRNA基因序列的菌株巧-T的系統進化樹；
[0024] 圖3為基于16S rRNA基因序列的菌株K的系統進化樹；
[0025] 圖4為基于16S rRNA基因序列的菌株H的系進化樹；
[00%]圖5為基于16S rRNA基因序列的菌株W的系統進化樹；
[0027]圖6為徑基阿特拉津質譜圖；
[00%]圖7為S聚氯酸質譜圖；
[00巧]圖8為生長曲線圖；
[0030] 圖9為降解曲線圖；
[0031] 圖10為溫度對降解效率的影響結果；
[0032] 圖11為pH對降解效率的影響結果；
[0033] 圖12為轉速對降解效率的影響結果；
[0034] 圖13為atz A和trz N擴增電泳圖；
[0035] 圖14為atz B、atz C擴增電泳圖；
[0036] 圖15為atz D和trz D擴增電泳圖；
[0037] 圖16為atz E和atz F擴增電泳圖。
【具體實施方式】
[0038] 下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。
[0039] 實施例1
[0040] CX-T菌種的篩選:采用富集培養、劃線分離的方法，從±壤樣品中分離出能降解阿 特拉津的菌株，并對其降解效率進行初步評價，篩選出高效降解菌株。
[0041 ] 1、所需試劑：阿特拉津標準品（ATR):Dr .Ehrenstorfer，99.8% ;阿特拉津原藥： TCI ,99.6%;乙臘等色譜純試劑購置上海安譜公司；酵母膏、蛋白腺、瓊脂粉等均為國產分 析純試劑。
[0042] 2、培養基
[0043] 基礎培養基（MSM，g/L):K2HP〇4 ? 3出0 1.60g、KH2P〇4 0.40g、薦糖3.00g、MgS〇4 ? 7此0 0.