鴿1型副粘病毒毒株af-1及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種鴿1型副粘病毒毒株AF?1及其應用。該毒株為鴿1型副粘病毒AF?1，其保藏號為：CCTCC NO：V 201613。利用鴿1型副粘病毒毒株AF?1制備滅活疫苗的方法，首先培養鴿1型副粘病毒毒株AF?1，得到AF?1株病毒液，向AF?1株病毒液中加入β?丙內酯；滅活得到混合液；再加入吐溫?80得到水相溶液；向白油中加入硬脂酸鋁，邊加邊攪拌直到完全透明為止，再加入吐溫?80得到油相溶液；向油相溶液中緩緩加入水相溶液置于乳化罐內進行乳化；得到滅活疫苗。本發明的滅活疫苗幫助鴿子有效抵抗鴿副黏病毒I型病毒引起的感染，極大的減少損失并促進鴿業的發展。該疫苗安全、有效，能應用于生產實踐。CCTCC NO：V 20161320160310
【專利說明】
鴿1型副粘病毒毒株AF-1及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及鴿1型副粘病毒，具體地指一種鴿1型副粘病毒毒株AF-1及其應用。
【背景技術】
[0002] 鴿瘟，又稱鴿新城疫或巴拉米哥病毒病，由鴿1型副粘病毒（Pigeon Paramyxovirus 1; PPMV-1)引起。該病流行廣泛，主要導致鶴下痢、神經癥狀及死亡等，給全 球養鴿業健康發展造成極大的障礙。不同品種、不同齡期的鴿子均易感。一般來說，鴿的發 病率可高達80~90%。根據具體免疫狀況以及飼養條件，其死亡率大致為30~80%。
[0003] 由于鴿子不直接影響大多數人的日常生活，并且養殖量相對較小。所以幾十年來 并沒有引起相關行業認識及國家的重視，目前缺乏針對鴿新城疫的專用疫苗用于預防控 制。長期以來，纟鳥子養殖戶大量使用雞源的新城疫疫苗進行免疫。雖然纟鳥1型副粘病毒與雞 新城疫病毒同屬副粘病毒，但由于其基因型存在差異，保護效果差強人意。隨著中國賽鴿運 動的快速發展，每年因賽鴿感染鴿新城疫而造成了無法挽回的巨大經濟損失。
[0004] 因此，迫切需要開發一種針對性的鴿新城疫疫苗。大的減少損失并促進鴿業的發 展。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供了一種鴿1型副粘病毒毒株AF-1及其應用。本發明利用鴿1型 副粘病毒毒株AF-1制備針對鴿瘟的效價穩定的滅活疫苗;該滅活疫苗幫助鴿子有效抵抗鴿 副黏病毒I型病毒引起的感染，極大的減少損失并促進鴿業的發展。
[0006] 為實現上述目的，本發明提供的一種鴿1型副粘病毒毒株AF-1，毒株為鴿1型副粘 病毒AF-1，其保藏號為:CCTCC N0:V 201613。
[0007] 上述毒株是2014年11月從安徽阜陽某鴿場的病死鴿中分離得到，經反轉錄聚合酶 鏈式反應（RT-PCR)擴增，連接基因測序鑒定該病毒確為鴿1型副粘病毒（Pigeon Paramyxovirus-1，PPMV-1)。
【申請人】將該病毒株命名為鴿1型副粘病毒AF-1株(PPMV-1AF-1 株）。并將該病毒于2016年3月10日保藏于中國武漢市武漢大學中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，其保藏號為:CCTCC N0:V 201613。
[0008] 進一步地，所述毒株AF-1的形態學特征為:在電子顯微鏡下，PPMV-1病毒顆粒呈多 形性，直徑約為100~250nm，有不同長度的細絲;有囊膜，在囊膜的外層有呈放射狀排列的 突起物或稱纖突;具有能刺激宿主產生抑制紅細胞凝集素和病毒中和抗體的抗原成分病毒 粒子以圓形為主，常因囊膜破損而呈現多形性;粒子內部含義直徑為16~20μπι的卷曲狀的 核衣殼，其表面覆蓋有6~10nm長的纖突。
[0009] 本發明還提供了一種上述鴿1型副粘病毒毒株AF-1在制備防治鴿副黏病毒I型病 毒引起地鴿瘟的疫苗中應用。
[0010]本發明還提供了一種利用鴿1型副粘病毒毒株AF-1制備滅活疫苗的方法，包括以 下步驟：
[0011] 1)培養鴿1型副粘病毒毒株AF-1，得到AF-1株病毒液，其中，病毒液中，AF-1株病毒 含量為 l〇7.QEID5〇/0.1mL;
[0012] 2)向步驟1)中得到的AF-1株病毒液中加入β-丙內酯;邊加邊混合，直至混合均勻， 滅活得到混合液；
[0013] 3)取注射用白油94份，加硬脂酸鋁2份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司 本-80 6份，混合后，高壓滅菌備用。;
[0014] 4)按體積比96:4混合液中加入吐溫-80,充分混勻，直到完全溶解，得到水相溶液；
[0015] 5)按體積比1: 2取水相溶液和油相溶液，然后向油相溶液中緩緩加入水相溶液置 于乳化罐內進行乳化;得到滅活疫苗。
[0016] 進一步地，所述步驟1)中，毒株AF-1培養過程中，是將鴿1型副粘病毒毒株AF-1置 于SPF雞胚進行培養。
[0017] 再進一步地，所述步驟2)中，AF-1株病毒液與β-丙內酯體積比為2000:1，再進一步 地，所述步驟2)中，滅活溫度為4°C，時間為8h。
[0018] 本發明的有益效果在于：
[0019] 1)本發明的毒株是從目前的流行毒株中篩選而出，具有免疫原性好、增殖滴度高 的特點。通過最佳接種量、最優培養溫度、最適收毒時間等條件的優化，可生產出效價穩定 的鴿1型副黏病毒。本發明還對該滅活疫苗的生產工藝、安全性、免疫保護效果、免疫程序和 保存期等研究做了評價，結果表明該疫苗安全、有效，能應用于生產實踐。
[0020] 2)本發明利用AF-1株制備的滅活疫苗經皮下注射能夠在鴿體內產生非常高的抗 體水平，并且幫助鴿子有效抵抗鴿副黏病毒I型病毒引起的感染，保護效率高達90%以上。 經免疫的鴿子，未發現明顯的不適反應，因此具有良好的安全性。
【具體實施方式】
[0021] 為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但 本發明的內容不僅僅局限于以下實施例。
[0022]實施例1病毒的分離與鑒定
[0023]從安徽某養鴿場采集病死鴿內臟組織經過RNA提取后經RT-PCR方法檢測后確定為 鴿副黏病毒1型，將該病毒株命名為鴿副黏病毒PPMV-1AF-1株。具體操作步驟如下：
[0024] 1、雞胚增殖
[0025] 將病料處理液加入雙抗(最終濃度為10000U/ml)，于33~35°C孵育30分鐘后，經絨 毛尿囊腔接種9~11日齡SPF雞胚，每份病料接種4雞胚枚，每胚0.2ml。接種的雞胚置33~35 °C孵育96小時，濕度保持為60~65%，定時照蛋。24小時內死亡的雞胚棄去。取24~96小時 死亡和存活的雞胚置2~8°C冷卻過夜或_20°C以下冷卻1~2小時，無菌收集尿囊液，12000 轉/分鐘離心10分鐘，以去除紅細胞和大的雜質，取上清進行紅細胞凝集(HA)試驗。對于第 一代尿囊液為陰性的取上清按以上方法繼續接種SPF胚盲傳三代，如仍為陰性則棄之，陽性 置-70°C以下保存備用。
[0026] 2、紅細胞凝集(HA)試驗向微量血凝板中加入25μ1 PBS，共做3組平行重復。吸取25 μL尿囊液并加入到第一列各孔，然后從左到右進行2倍系列稀釋至第11列各孔，從第11列各 孔吸取25μ1混合液，棄去。第12列各孔不加抗原，作為對照孔。然后向每孔中加入25μ1 1% 紅細胞懸液。將板震蕩1分鐘，然后室溫靜置25~30分鐘，判定結果。
[0027] 3、病毒RNA的提取，cDNA的合成以及基因的擴增
[0028] 3.1、病毒RNA的提取
[0029] 將已研磨好的病料6000rpm離心5min，取上清200yL，加入1.5ml的EP管中，每管加 入lml RNAiso Reagent，用移液器吹打均勻后室溫靜置lOmin;每管加入200yL的三氯甲烷， 渦旋儀混勻，置冰浴lOmin后，4°C，12000rpm，離心10min。取600yL上清轉移至新的離心管 中，并加入等體積的異丙醇，禍旋儀混勾后室溫靜置lOmirufC，12000rpm，離心10min。棄上 清(除凈異丙醇），沿離心管壁緩緩加入lml無水乙醇，反復顛倒混勻，7800rpm，5min。將除去 乙醇的基因組RNA沉淀在室溫下干燥5-10min，緩慢加入適量的DEPC水(20-50yL)溶解基因 組 RNA。
[0030] 3.2、1型副粘病毒〇0嫩的合成
[0031] 反轉錄用的引物序列Unil2(單鏈）：5'-AGCAAAAGCAGG-3' ；鴿副黏病毒cDNA合成： [0032]在20yL反轉錄體系中進行，依次加入以下組分：
[0035] 將上述試劑或酶混勻后置PCR儀上，于42 °C下反應60min，95 °C下反應5min進行反 轉錄，反應產物直接用于PCR或于4°C下保存備用。
[0036] 3.3、1型副粘病毒的？0?鑒定
[0037] 根據鴿副黏病毒1型F基因設計引物，引物序列：
[0038] 上游引物：5'-(^&七區區區(：1：(^&&&(^1:1：(31：-3'；
[0039] 下游引物：5'_ggtcatgtt cttgtagtgg-3'。
[0040] 采用20yL體系進行DNA擴增，反應體系及程序如下：
[0042] PCR 反應參數：951€5111丨11;941€3〇8,55 1€3〇8,721€3111丨11，30個循環；72。(：延伸1〇11^11。 F基因的擴增結果分別見圖1，將PCR產物純化后連接pMD18-T載體(購自寶生物工程大連有 限公司，其載體圖譜見寶生物工程大連有限公司的PMD18-T載體說明書）。
[0043] 4、病毒的保藏
[0044] 發明人對該毒株(AF-1株)進行了生物保藏。保藏單位為：中國典型培養物保藏中 心(CCTCC)保藏，其保藏號為:CCTCC N0:V 201613。
[0045] 實施例2滅活疫苗1的制備
[0046] 1、病毒含量測定
[0047]將病毒液用滅菌的生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10- 83個稀釋度尿囊腔 內接種10日齡的SPF雞胚，每個稀釋度接種5枚，0. lml/胚，記錄24~120小時雞胚感染情況， 計算EID5Q，每0.1ml病毒含量應多107' QEID5Q。經測定，收獲尿囊液混合后EID5Q見下表：
[0048] 表 1 Reed-Muench 法計算 EID5Q 結果
[0049]
[0050]計算方法如下：
[0052] lgEID5Q =高于50%感染的病毒最高稀釋度的對數+距離比例X稀釋度之間的差。
[0053] 距離比例=〇.78
[0054] lgEID5〇 = -7+(-lX0.78)=-7.78
[0055] 則 EID5q=10-7.78/0.1ml
[0056] 2、病毒滅活
[0057]將上述胚液以4層紗布及一層細銅紗網濾過，混合于一個大玻璃瓶內。然后按 0.05%加入β-丙內酯，隨加隨搖，使其充分混合。然后在4°C滅活（以瓶內溫度達到4°C開始 計時)8小時。
[0058] 3、滅活檢驗
[0059] 取10日齡SPF雞胚5個，0.2ml/胚，接種后每日照蛋2次，觀察5日，并對所有胚液分 別測定血凝價，通過對雞胚的觀察和雞胚液的血凝價的測定，確定胚液的滅活效果。血凝價 低于1:4盼為陰性，陰性再次接種10日齡SPF雞胚5個，0.2ml/胚，5天后測血凝價，仍為陰性 的盼為滅活合格。檢測結果見下表：
[0060] 表2滅活病毒接種-SPF雞胚后HA效價
[0061]
[0062] 4、疫苗乳化
[0063] 4.1油佐劑滅活疫苗1的制備
[0064] 4.1油相制備取注射用白油94份，加硬脂酸鋁2份，邊加邊攪拌，直到完全透明為 止，再加入司本-80 6份，混合后，高壓滅菌備用。
[0065] 4.2水相制備將滅活的鴿副粘病毒I型AF-1株病毒液96份，加入滅菌的吐溫-80 4 份，充分搖動，直到吐溫-80完全溶解。
[0066] 4.3乳化取6份油相放入乳化罐內，慢速攪拌同時緩緩加入3份水相，加完后，中速 混合，然后高速乳化，制成滅活疫苗。
[0067] 實施例3
[0068] 1、疫苗安全性試驗
[0069]用21~30日齡鴿副粘病毒I型抗體陰性鴿15只，10只各頸部皮下注射疫苗lml，另5 只作對照。觀察14日，應不出現因注射疫苗而引起的局部和全身不良反應。檢驗結果見表： [0070]表3滅活疫苗超劑量接種21~30日齡鴿副粘病毒I型抗體陰性鴿安全性檢測
[0072] 2、免疫以及攻毒保護力實驗
[0073] 2.1、免疫
[0074]用21~30日齡鴿副粘病毒I型抗體陰性鴿15只，10只各頸部皮下注射疫苗200μ1， 另5只作對照。
[0075] 2.2、血清抗體檢測
[0076]接種后21~28日，每只各采血，分離血清，進行HI抗體效價測定。免疫組HI抗體效 價的幾何平均值應不小于41og2,未免疫對照組HI抗體效價的幾何平均值應不大于21og2。 免疫后21天采血，檢測血清抗體，抗體檢測HI結果見下表：
[0077]表4滅活疫苗免疫后血清抗體檢測
[0079] 2.3、攻毒保護力實驗
[0080] 接種后21~28日，每只鴿肌肉注射疫苗病毒AF-1株105'QELD 5Q，觀察14日。攻毒后結 果見下表：
[0081 ]表5滅活疫苗免疫后攻毒保護結果
[0083] 試驗結果表明：該疫苗安全、無可見不良副反應，疫苗抗體產生時間快，抗體效價 41og2以上能有效抵抗強毒株AF-1株感染。
[0084] 其它未詳細說明的部分均為現有技術。盡管上述實施例對本發明做出了詳盡的描 述，但它僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可以根據本實施例在不經 創造性前提下獲得其他實施例，這些實施例都屬于本發明保護范圍。
【主權項】
1. 一種鴿1型副粘病毒毒株AF-1，其特征在于:毒株命名為鴿1型副粘病毒AF-1，其保藏 號為：CCTCC NO:V 201613。2. 根據權利要求1所述鴿1型副粘病毒毒株AF-1，其特征在于:所述毒株AF-1的形態學 特征為:在電子顯微鏡下，PPMV-1病毒顆粒呈多形性，直徑約為100~250nm，有不同長度的 細絲;有囊膜，在囊膜的外層有呈放射狀排列的突起物或稱纖突;具有能刺激宿主產生抑制 紅細胞凝集素和病毒中和抗體的抗原成分病毒粒子以圓形為主，常因囊膜破損而呈現多形 性;粒子內部含義直徑為16~20μπι的卷曲狀的核衣殼，其表面覆蓋有6~10nm長的纖突。3. -種權利要求1所述的鴿1型副粘病毒毒株AF-1在制備防治鴿副黏病毒I型病毒引起 地鴿瘟的疫苗中應用。4. 利用權利要求1所述鴿1型副粘病毒毒株AF-1制備滅活疫苗的方法，其特征在于:包 括以下步驟： 1) 培養鴿1型副粘病毒毒株AF-1，得到AF-1株病毒液； 2) 向步驟1)中得到的AF-1株病毒液中加入β-丙內酯;邊加邊混合，直至混合均勻，滅活 得到混合液； 3) 取注射用白油94份，加硬脂酸鋁2份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司本-80 6份，混合后，高壓滅菌備用； 4) 按體積比96:4混合液中加入吐溫-80，充分混勻，直到完全溶解，得到水相溶液； 5) 按體積比1:2稱取水相溶液和油相溶液，然后將油相溶液和水相溶液置于乳化罐內 進行乳化;得到滅活疫苗。5. 根據權利要求4所述鴿1型副粘病毒毒株AF-1制備滅活疫苗的方法，其特征在于:所 述步驟1)中，毒株AF-1培養過程中，是將鴿1型副粘病毒毒株AF-1置于SPF雞胚進行培養。6. 根據權利要求5所述鴿1型副粘病毒毒株AF-1制備滅活疫苗的方法，其特征在于:所 述病毒液中，AF-1株病毒數量為10 7'QEID5〇/0. lmL。7. 根據權利要求4所述鴿1型副粘病毒毒株AF-1制備滅活疫苗的方法，其特征在于:所 述步驟2)中，AF-1株病毒液與β-丙內酯體積比為2000:1。8. 根據權利要求6所述鴿1型副粘病毒毒株AF-1制備滅活疫苗的方法，其特征在于:所 述步驟2)中，滅活溫度為4°C，時間為8h。
【文檔編號】C12N7/00GK105936893SQ201610361716
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年7月14日
【發明人】陳博
【申請人】武漢巴蒂思生物科技有限公司