篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法
【專利摘要】本發明所述篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其通過一漿細胞表面表現的標記，使一融合細胞所分泌的一目標抗體結合于該融合細胞表面，再以一含有一標定物的抗原與該融合細胞反應，用以篩選出具抗原專一性的融合細胞。該方法能夠達到大幅縮短單株抗體制備的時間進程。
【專利說明】
篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法
技術領域
[0001] 本發明有關于單株抗體的制備，特別指一種篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方 法。
【背景技術】
[0002] 在1975年的研究中揭露以融合瘤制備單株抗體的技術，而該技術主要通過將抗原 多次注射至動物體內，使該動物產生免疫反應，制造出抗體，再將該動物的脾臟細胞利用聚 乙二醇(polyethylene glycol，PEG)與骨髓瘤細胞進行融合反應。通過骨髓瘤細胞及脾臟 細胞的特性，如體外生存壽命、核酸生合成的能力，并且搭配HAT培養基（Hypoxanthine、 Aminopterin、Thymidine )，篩選出脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合成功的細胞，再將篩選出的 融合細胞單株化，最后以酵素連結免疫吸附分析法偵測抗原的專一性。一般來說，動物通過 免疫反應產生抗體須耗時至少1個月，進行融合反應約耗時1天，以HAT培養基篩選融合細胞 須耗時數周，單株化融合細胞須耗時1個月，最后偵測抗原專一性也須1個月。
[0003] 誠如眾所周知，單株抗體能應用于診斷或醫療等領域上，使其能帶來數百億以上 的商機，因此，許多廠商皆致力于縮短單株抗體的制備過程，以期能快速地獲得有效的單株 抗體。目前已有在抗原設計及免疫過程的兩步驟中進行改良，用以縮短免疫過程所耗費的 時間。但，在篩選抗原專一性抗體的步驟上，除大型公司能通過機器人進行高通量篩選外， 仍無法大幅提升篩選單株抗體的效率。而以機器人進行篩選的方式須耗費大量開發成本， 不僅會造成產品價格提高，更無法廣為各規模廠商使用，自然對于縮短篩選的時間進程無 實際助益。
[0004]據此，開發出一種能夠快速篩選融合瘤細胞的方法乃為目前生物醫藥產業的重要 課題。
【發明內容】
[0005] 因此，本發明的主要目的即在于提供一種篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法， 其通過位于融合細胞表面的漿細胞表面表現分子，捕捉融合細胞所分泌的單株抗體，再以 具有標定物的抗原與該融合細胞反應，當該融合細胞能夠表現該標定物時，顯示該單株抗 體與該抗原結合，而篩選出抗原專一性的融合細胞。
[0006] 本發明的另一目的在于提供一種篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其能大幅 地縮短制備單株抗體的時間進程，并且，增加開發出有效的單株抗體的效率。
[0007] 本發明的次一目的在于提供一種篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其操作方 式簡單，不須花費大量成本購買大型機臺，因而能夠適用于各類規模的抗體制造公司。
[0008] 緣是，為能達成上述目的，本發明所述篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其通 過一漿細胞表面表現的標記，使一融合細胞所分泌的一目標抗體結合于該融合細胞表面， 再以一含有一標定物的抗原與該融合細胞反應，用以篩選出具抗原專一性的融合細胞。
[0009] 較佳地，該目標抗體與該標記間通過至少兩個抗體相連結，并且，該兩個抗體間通 過一連結分子相連結。
[0010]更進一步來說，該兩個抗體分別為一第一抗體及一第二抗體。
[0011]該第一抗體，具有一第一結合分子，與該連結分子相結合，一第一抗原結合點，與 位于該融合細胞細胞表面的該標記相結合，其中，又以該第一結合分子為生物素(biotin) 具有較佳功效。
[0012] 該第二抗體，具有一第二結合分子，與該連結分子相結合，一第二抗原結合點，該 目標抗體相結合，其中：
[0013] 其中，又以該第二結合分子為生物素具有較佳功效。
[0014] 其中，又以該第二抗體與該目標抗體源自不同動物時具有較佳功效。
[0015] 而該連結分子為卵白素(Avidin)、鏈霉親和素（streptavidin)或信號酶。
[0016]較佳地，該標定物為熒光物、磁性物或任何一本發明所屬技術領域技術人員周知 以作為篩選標定物。
[0017] 較佳地，該標記為以⑶(cluster designation)命名的分子標記，具體來說，該標 記為CD138。
[0018]本發明的有益效果在于：
[0019] 本發明所述篩選具抗原專一性的融合瘤細胞的方法能夠取代已知技術中通過酵 素連結免疫吸附法偵測抗原專一性抗體的步驟，能夠達到大幅縮短單株抗體制備的時間進 程、因應市場需求的功效，并且，本發明所述方法操作簡單、成本低廉，達到降低開發成本的 功效。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發明的較佳實施例的示意圖。
[0021] 圖2為以流式細胞技術分析所得的FSC/SSC圖，其中，R-1為選取區域。
[0022] 圖3為分析選取細胞中融合細胞的比例的結果。
[0023]圖4為分析GFP熒光強度明顯增加的細胞所占比例的結果。
[0024]圖5為分析有⑶-138PE信號的細胞所占比例的結果。
[0025]圖6以顯微鏡觀察細胞形態的結果。
[0026]圖7以熒光顯微鏡觀察細胞形態的結果。
[0027] 圖8為本發明所述方法的時間進程示意圖。
【具體實施方式】
[0028] 本發明揭露一種篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其通過位于融合細胞表面 的漿細胞表面表現分子，捕捉融合細胞所分泌的單株抗體，再以具有標定物的抗原與該融 合細胞反應，通過觀察融合細胞是否表現該標定物的特性而能有效地篩選出抗原專一性的 融合細胞。由于本發明所述篩選具抗原專一性的融合瘤細胞的方法能夠取代已知技術中通 過酵素連結免疫吸附法偵測抗原專一性抗體的步驟，能夠達到大幅縮短單株抗體制備的時 間進程、因應市場需求的功效，并且，本發明所述方法操作簡單、成本低廉，達到降低開發成 本的功效。
[0029]本發明的說明書及權利要求書所述名詞，除非有另外加以定義，皆以本發明所屬
技術領域技術人員所能理解的意義解釋。
[0030] 本發明所述"融合細胞"或"融合瘤細胞"，將兩不同種細胞以細胞融合法合并為一 個細胞。在本發明中，該兩不同種細胞分別為一經抗原免疫的脾細胞、自脾細胞分離的B細 胞或漿細胞，及一瘤細胞。
[0031] 本發明所述"細胞融合法"，通過化學方法、物理方法、生物方法將兩不同種細胞以 細胞融合法結合成為一細胞，其中，化學方法為目前制備單株抗體中最常用的技術，通過如 聚乙二醇的化學試劑進行細胞融合;物理方法通過如電脈沖的方式使細胞融合;生物方法 則通過滅活的病毒誘導細胞進行融合。
[0032] 本發明所述"抗原免疫"，指能制造單株抗體的第一步驟，大體來說，欲使脾細胞、 自脾細胞取出的B細胞或衆細胞能夠分泌特定抗體，會通過釋放一預定抗原至一動物體內， 誘使其B細胞成熟增殖，并且能夠產生抗體，此時，該個體體內會有該特定抗體生成;或是在 體外培養細胞的過程中，給予抗原，使之進行體外免疫反應，而能分泌出抗體。
[0033] 本發明所述"瘤細胞"，也有稱為"癌細胞"，其特征能在培養基中具有不斷分裂的 能力，目前大多以骨髓瘤細胞進行單株抗體的制備。舉例來說，NS-1骨髓瘤細胞、SP2/0骨髓 瘤細胞、P3X63Ag8. U1骨髓瘤細胞為小白鼠 BALB/c的癌細胞株;或RPMI8226骨髓瘤細胞、MC/ CAR骨髓瘤細胞、IM-9骨髓瘤細胞、UC729-6骨髓瘤細胞或LTR228骨髓瘤細胞為人類的癌細 胞株。
[0034] 本發明所述"熒光物"，能產生不同熒光顏色及強度，在生物醫學領域中，多用以作 為檢測、分析、判斷、診斷的標定分子。一般來說，當細胞被熒光物標定后，以如鐳射的光源 照射該細胞，使其發出特定的熒光顏色及強度，再通過如流式細胞儀等儀器篩選出可以表 現熒光物的細胞。
[0035] 本發明所述"磁性物"，為磁性細胞分離系統中所使用的標定物，例如以與抗體共 價結合的磁珠。而細胞經過磁性物標記后，該細胞留存于具有磁性的分離柱上，再通過移除 磁力，收集脫離自分離柱的細胞，達到分離、篩選細胞的目的。
[0036] 以下，將茲舉本發明的一較佳實施例，并且搭配圖式做更進一步說明如后。
[0037] 請參閱圖1，本發明的較佳實施例揭露一種篩選具抗原專一性的融合瘤細胞的方 法(10)，其包含下列步驟：
[0038] 步驟101:取一經抗原免疫的漿細胞(20)與一骨髓瘤細胞(30)，以細胞融合法制備 一融合細胞(40 )，而該融合細胞細胞表面上具有漿細胞表面抗原CD138 (41)。
[0039] 步驟102:取一生物素共輒抗⑶138的單株抗體(50)、一卵白素(60)、一生物素抗老 鼠免疫球蛋白的單株抗體(70)，分別依序加入含有該融合細胞(40)的環境中，進行培養。
[0040] 步驟103:取一熒光抗原(80)，加入含有步驟102的該融合細胞的環境中進行反應， 其中，該抗原(80)與在步驟101中誘導漿細胞產生免疫反應相同。
[00411 步驟104:以流式細胞儀篩選出得以表現熒光的融合細胞(40)。
[0042] 通過上述方法，由于該融合細胞（40)的細胞表面會表現漿細胞表面抗原CD138
[41] ，再通過添加不同抗體及化合物與該融合細胞反應(40)，該生物素共輒抗CD138的單株 抗體(50)以其抗原結合點與該表面抗原CD138(41)結合，再以該卵白素(60)與該生物素共 輒抗CD138的單株抗體(50)及該生物素抗老鼠免疫球蛋白的單株抗體(70)相連結，而使該 兩個單株抗體(50)(70)與該卵白素(60)串接形成一鏈形結構。該鏈形結構一端與該表面抗 原CD138(41)連結，另一端通過該生物素抗老鼠免疫球蛋白的單株抗體(70)的抗原結合點 捕捉該融合細胞(40)所分泌的目標抗體(42)。由于該目標抗體(42)與該熒光抗原(80)間會 產生專一性結合，因此，當該鏈形結構的另端與該目標抗體(42)結合時，通過該目標抗體
[42] 會與該熒光抗原(80)結合，該融合細胞能夠表現熒光，用以能夠通過觀察該融合細胞 (40)上是否表現熒光，輕易地以儀器篩選出能夠分泌抗原專一性單株抗體的融合細胞。
[0043] 更進一步來說，該標定物不以熒光物為限，而以任意以本發明所屬技術領域技術 人員所周知的標定物取代，如磁珠，也能達成本發明的功效。
[0044] 再者，本發明的主要特征在于通過位于融合細胞細胞表面的表現分子，如抗原，使 該目標抗體與該融合細胞相結合，因而，用以連結該融合細胞與該目標抗體的抗體、化合物 及其兩者的組合，能依據本發明所屬技術領域技術人員的一般知識加以變化或替換，例如： 以鏈霉親和素或信號酶取代卵白素。
[0045] 為進一步說明本發明及其功用，茲舉一實施例并搭配附圖進行詳細說明如后。
[0046] 實施例:融合反應
[0047] 取轉入GFP的NS1細胞，進行培養。在進行融合前1天，將NS 1細胞進行繼代，控制隔 天細胞滿度約5~6成。將培養完成的NS1細胞以lOOOrpm離心，倒掉上清液后，計算NS1細胞 的細胞數量。
[0048]將已免疫完成的小鼠在進行融合前3天先進行免疫前增幅（prefusion boosting)。在進行融合反應當天，以異氟醚將老鼠麻醉，將脾臟摘取下來，放入裝有5毫升 無血清DMEM的6公分培養皿中，以200目鋼篩將脾臟均質。取5毫升的脾臟細胞懸浮液，將70μ m篩網放在50ml離心管中，使脾臟細胞懸浮液通過70μπι篩網后，以10毫升的無血清DMEM沖洗 篩網，并以lOOOrpm離心5分鐘，倒掉上清液，加入5毫升紅血球裂解緩沖液，反應5分鐘。反應 后，以35毫升的無血清DMEM稀釋紅血球裂解緩沖液，以lOOOrpm離心5分鐘，倒掉上清液，加 入20毫升的無血清DMEM懸浮脾細胞，計算細胞數。
[0049] 將NS1細胞與脾細胞以1:1~1: 5的比例混合均勻，緩慢加入1~2毫升融合緩沖液 (50%PEG_4000in DMEM, serum free)，再加入7毫升無血清DMEM，以 lOOOrpm進行離心5分 鐘，倒掉上清液，加入1 〇毫升無血清DMEM后，將細胞放入細胞培養箱中培養。
[0050] 計算融合細胞的細胞數量，并從中分出部分作為控制組。將剩下的融合細胞放入 離心管中，以lOOOrpm離心5分鐘，倒掉上清液，以1毫升DMEM-20(20%FBS、lmM Sodium pyruvate、10mM HEPES、10μg/ml gentamicin)懸浮均勾，再加入 10μ1 抗體（Biotin-anti-mouse CD138，Avidin，Biotin-anti_mouse IgG)，在4°C下反應1 小時。加入3毫升染色液 (staining buffer;PBS，3%FBS,0·22μηι filtered)稀釋抗體反應，以lOOOrpm離心5分鐘， 倒掉上清液，再以1毫升DMEM-20懸浮均勻，計算細胞數，將細胞調整至5xl0 5-lxl06cells/ml 之間。
[00511將細胞懸浮液吸至6孔盤中，例如：
[0053] 加入10μ1 PE-antigen，混合均勻。加入1毫升DMEM-20于每一個孔之中，例如：
[0055]在37 °C反應2小時以上，加入3毫升染色液稀釋反應，將細胞吸入離心管中，以 lOOOrpm進行離心5分鐘，去除上清液，再以1毫升染色劑懸浮均勻，并使細胞懸浮液通過70μ m篩網，計算細胞數。最后，以熒光活化流式細胞分選儀進行篩選。
[0056] 請參閱圖2至圖7,其顯示選取區域為R-1，融合細胞占所選取細胞的14.1%，GFP熒 光強度明顯增加的細胞占2.72% (圖4中H-2區域的細胞），有⑶-138PE信號的細胞占6.12% (圖5中H-3區域的細胞）。根據上述實施例的方法可分選出有綠色熒光蛋白表現的NS1細胞 與正常小鼠脾臟細胞融合有⑶138-PE染色。
[0057] 此外，如圖8所示時間進程表可知，將卵蛋白（0VA)與輔劑CFA(complete Freund's adjuvant)以腹腔注射誘導小鼠免疫反應，經過14天后，再以腹腔注射的方式，通過卵蛋白 (0VA)與輔劑IFA(incomplete Freund's adjuvant)進行免疫反應，經過14天后，將小鼠處 死，取出脾細胞，經處理后與帶有綠色熒光蛋白的NSl(NSl-GFP)進行融合反應，1天后，透過 加入抗體及染色，并通過熒光活化流式細胞分選儀篩選出可表現熒光的細胞，此即為能夠 分泌抗原專一性單株抗體的融合細胞。據此可知，由本發明所述方法能快速篩選出分泌抗 原專一性單株抗體的融合細胞。
[0058] 以上，以上僅是通過各該實施例詳細說明本發明，熟知該技術領域的人在不脫離 本發明精神下，而對于說明書中的實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本發明權 利要求所涵蓋。
【主權項】
1. 一種篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其特征在于，其通過一漿細胞表面表現 的標記，使一融合細胞所分泌的一目標抗體與該融合細胞相結合，再以一含有一標定物的 抗原與該融合細胞反應，用以篩選出具抗原專一性的融合細胞。2. 如權利要求1所述篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其特征在于，該目標抗體與 該標記間通過至少兩個抗體相連結，并且，該兩個抗體間通過一連結分子相連結。3. 如權利要求2所述篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其特征在于，抗體包含有： 一第一抗體，具有一第一結合分子，與該連結分子相結合，一第一抗原結合點，與位于 該融合細胞細胞表面的該標記相結合； 一第二抗體，具有一第二結合分子，與該連結分子相結合，一第二抗原結合點，該目標 抗體相結合。4. 如權利要求3所述篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其特征在于，該第一結合分 子為生物素。5. 如權利要求3所述篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其特征在于，該第二結合分 子為生物素。6. 如權利要求2所述篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其特征在于，該連結分子選 自由卵白素、鏈霉親和素及信號酶所組成的群。7. 如權利要求3所述篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其特征在于，該第二抗體及 該目標抗體來自于不同動物。8. 如權利要求1所述篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其特征在于，該標定物選自 由熒光物及磁性物所組成的群。9. 如權利要求1所述篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其特征在于，該標記為以CD (cluster designation)命名的分子標記。10. 如權利要求9所述篩選具抗原專一性融合瘤細胞的方法，其特征在于，該標記為 CD138〇
【文檔編號】G01N33/58GK105936892SQ201610123960
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年3月4日
【發明人】賴治暄
【申請人】艾博生技抗體股份有限公司