一種生物法制備脂肪醇的方法
【專利摘要】本發明涉及一種生物法制備脂肪醇的方法。本發明首次揭示一種用生物法來催化脂肪酸或脂肪酸甲酯生成脂肪醇的方法，該方法適用于飽和脂肪醇及不飽和脂肪醇的制備，且特別有利于降低不飽和脂肪酸的生產成本。
【專利說明】
一種生物法制備脂肪醇的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物化工領域，更具體地，本發明涉及一種生物法制備脂肪醇的方法。
【背景技術】
[0002] 脂肪醇是具有8至22個碳原子鏈的脂肪族的醇類，有些脂肪醇為不飽和脂肪醇。 脂肪醇在自然界中并不大量存在，因此，需要利用人工方法進行合成，以滿足其工業應用所 需。
[0003] 目前，不飽和脂肪醇是通過化學法來合成的，由于C = C不飽和雙鍵的存在，利用 化學法來還原羧酸到醇需要用到一些貴重的金屬催化劑，而且選擇性并不是很好。因此，本 領域還需要發掘一些新的制備不飽和脂肪醇的方法，以降低成本，提高制備效率。
[0004] 現有技術中，用生物法來選擇性還原不飽和脂肪酸的相關方法目前還沒有報導。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種生物法制備脂肪醇的方法。
[0006] 在本發明的第一方面，提供一種制備脂肪醇的方法，所述方法包括：以脂肪酸為底 物，利用羧酸還原酶將脂肪酸轉化為脂肪醛；利用醛還原酶將脂肪醛轉化為脂肪醇。
[0007] 在一個優選例中，所述的脂肪酸如下獲得：以脂肪酸酯為底物，利用酯水解酶將脂 肪酸酯轉化為脂肪酸。
[0008] 在另一優選例中，所述的脂肪酸酯包括（但不限于）：脂肪酸甲酯，脂肪酸乙酯，月旨 肪酸丙酯，脂肪酸丁酯等；較佳地為脂肪酸甲酯。
[0009] 在另一優選例中，所述的羧酸還原酶包括：MsCAR，MmCAR (Mycobacterium marinum,UniProt accession number B2HN69)，NsCAR(Nocardia sp. NRRL 5646)；
[0010] 所述的醛還原酶包括：AlrA 或 YjgB(E. coli，AAC77226)
[0011] 所述的酯水解酶包括：CALB，HDE，Lc α E7, BioH，YbaC 或 TesA。
[0012] 在另一優選例中，所述的羧酸還原酶、醛還原酶、酯水解酶是重組表達的酶。
[0013] 在另一優選例中，所述的方法還包括：利用EntD或Sfp(phosphopantetheine transferase，磷酸泛酰疏基乙胺轉移酶；其中，EntD基因來自于大腸桿菌Escherichia coli，sfp基因來自于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis)促進羧酸還原酶的活性。
[0014] 在另一優選例中，所述的MsCAR具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列；和/或
[0015] 所述的AlrA具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列；和/或
[0016] 所述的Lc α E7具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列或SEQ ID N0:6中第33-570 位所示的氨基酸序列；優選地是氨基酸序列如SEQ ID N0:6中第33-570位所示的截短體； 和/或
[0017] 所述的EntD具有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列。
[0018] 在另一優選例中，羧酸還原酶的表達盒、醛還原酶的表達盒被串聯于一個表達質 粒中；$父佳地，該表達質粒中還串聯有酯水解酶的表達盒；更佳地，該表達質粒中還串聯有 EntD的表達盒。
[0019] 在另一優選例中，所述的脂肪酸為不飽和脂肪酸，所述的脂肪醇為不飽和脂肪醇， 所述的脂肪醛為不飽和脂肪醛，所述的脂肪酸酯為不飽和脂肪酸酯；或
[0020] 所述的脂肪酸為飽和脂肪酸，所述的脂肪醇為飽和脂肪醇，所述的脂肪醛為飽和 脂肪醛，所述的脂肪酸酯為飽和脂肪酸酯。
[0021] 在本發明的另一方面，提供一種重組的表達構建物，所述的表達構建物中包括： 羧酸還原酶的表達盒，醛還原酶的表達盒；較佳地，該表達質粒中還包括：酯水解酶的表達 盒；更佳地，該表達質粒中還包括：EntD的表達盒。
[0022] 在另一優選例中，所述的表達構建物是重組表達載體。
[0023] 在另一優選例中，所述的表達載體是pEZ07或pEZOl載體。
[0024] 在本發明的另一方面，提供一種重組的細胞，所述的細胞中包括所述的表達構建 物。
[0025] 在另一優選例中，所述的細胞是原核細胞。
[0026] 在另一優選例中，所述的原核細胞是大腸桿菌細胞。
[0027] 在本發明的另一方面，提供一種發酵法制備脂肪醇的方法，所述方法包括：培養所 述的重組的細胞，并在培養體系中添加脂肪酸或脂肪酸酯作為反應底物，從而獲得脂肪醇。
[0028] 在另一優選例中，所述發酵法制備脂肪醇的方法中，細胞的培養條件是 33±4°C (較佳地為 33±2°C )，pH6. 8±0. 2,溶氧 30% ±20%，通風量 4±2vvm。
[0029] 在另一優選例中，所述發酵法制備脂肪醇的方法中，細胞是大腸桿菌，以IPTG誘 導細胞表達。
[0030] 在本發明的另一方面，提供一種用于制備脂肪醇的試劑盒，所述的試劑盒中包 括：
[0031] 包含有羧酸還原酶的表達盒、醛還原酶的表達盒、酯水解酶的表達盒的表達構建 物或細胞；較佳地，所述的表達構建物或細胞還包含酯水解酶的表達盒；更佳地，所述的表 達構建物或細胞還包含EntD的表達盒。
[0032] 在一個優選例中，所述的試劑盒中還包括反應底物：脂肪酸（包括：飽和或不飽和 脂肪酸）或脂肪酸酯（包括：飽和或不飽和脂肪酸）。
[0033] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0034] 圖 1、pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD 質粒構建圖。
[0035] 圖2、3L發酵罐中生物催化過程圖（實施例3)。
[0036] 圖3、發酵液的后處理過程圖（實施例4)。
【具體實施方式】
[0037] 本發明人經過深入的研究，首次揭示了一種用生物法來催化脂肪酸或脂肪酸甲酯 生成脂肪醇的方法。本發明的方法適用于飽和脂肪醇及不飽和脂肪醇的制備，且特別有利 于降低不飽和脂肪酸的生產成本。
[0038] 術語
[0039] 如本文所用，如本文所用，所述的"表達盒"或"基因表達盒"是指包含有表達目的 多肽（本發明中為羧酸還原酶、醛還原酶、酯水解酶或EntD)所需的所有必要元件的基因表 達系統，通常其包括以下元件：啟動子、編碼多肽的基因序列，終止子；此外還可選擇性包 括信號肽編碼序列等；這些元件是操作性相連的。
[0040] 如本文所用，所述的"構建物"或"表達構建物"是指重組DNA分子，它包含預期的 核酸編碼序列，其可以包含一個或多個基因表達盒。所述的"構建物"通常被包含在表達載 體中；這個DNA分子還包含轉錄在體外或體內可操作的連接編碼序列所必需的或預期的適 合的調控元件。"調控元件"在這里指的是可一定程度上控制核酸序列表達的核苷酸序列。 可作為典范的調控元件包括增強子，內核糖體進入位點（IRES)，復制起點，多腺苷酸化信 號，啟動子，轉錄終止序列，以及上游調節區，這些調控元件有助于核酸的復制、轉錄、轉錄 后修飾等。
[0041] 如本文所用，所述的"可操作地連接"或"操作性連接"是指兩個或多個核酸區域 或核酸序列的功能性的空間排列。例如：啟動子區被置于相對于目的基因核酸序列的特定 位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被"可操作地連接" 到該核酸序列上。
[0042] 如本文所用，所述的"脂肪醇"包括"飽和脂肪醇"以及"不飽和脂肪醇";較佳地為 "不飽和脂肪醇"。
[0043] 反應原理
[0044] 一種方案是：以脂肪酸為底物，利用羧酸還原酶將脂肪酸轉化為脂肪醛；之后，利 用醛還原酶將脂肪醛轉化為脂肪醇。
[0045] 另一種方案是：以脂肪酸酯為底物，利用酯水解酶將脂肪酸酯轉化為脂肪酸，再以 脂肪酸為底物，利用羧酸還原酶將脂肪酸轉化為脂肪醛；之后，利用醛還原酶將脂肪醛轉化 為脂肪醇。
[0046] 以生產9-癸烯醇為例，反應方法如下：
[0048] 酶或多肽及其編碼核酸
[0049] 本發明首次實現了利用羧酸還原酶、醛還原酶，以及可選的酯水解酶或EntD進行 脂肪醇的生產制備。
[0050] 所述的羧酸還原酶包括（但不限于）：MsCAR，MmCAR，NsCAR ;所述的醛還原酶包括 (但不限于）：AlrA，YjgB ;所述的酯水解酶包括（但不限于）：CALB，HDE，LcaE7，BioH，YbaC 或TesA。作為本發明的優選方式，還利用利用EntD或sfp促進羧酸還原酶的活性。
[0051] 在本發明中，上述的酶或多肽可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自動植 物或微生物。此外，所述的酶或多肽也可以是人工制備的，比如可以根據常規的基因工程重 組技術來生產重組酶或多肽。
[0052] 多種適合的酶或多肽可被應用于本發明。所述的酶或多肽包括全長的酶或多肽或 其生物活性片段（或稱為活性片段）。經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而 形成的酶或多肽的氨基酸序列也包括在本發明中。酶或多肽的生物活性片段的含義是指作 為一種多肽，其仍然能保持全長的酶或多肽的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活 性片段至少保持50%的全長酶或多肽的活性。在更優選的條件下，所述活性片段能夠保持 全長酶或多肽的 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、或100% 的活性。酶或多肽或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經氨基酸替 換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當替換氨基酸是本領域公知的技術， 所述技術可以很容易地被實施，并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術使本領域 人員認識到，一般來說，在一種多肽的非必要區域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活 性。見 Watson 等 Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224〇
[0053] 本發明也可采用經修飾或改良的酶或多肽，比如，可采用為了促進其半衰期、有效 性、代謝和/或多肽的效力而加以修飾或改良的酶或多肽。所述經過修飾或改良的酶或多 肽可以是與天然存在的酶或多肽具有較小的共同點，但也能發揮與野生型相同或基本相同 的功能，且不會帶來其它不良影響。也就是說，任何不影響酶或多肽的生物活性的變化形式 都可應用于本發明中。
[0054] 本發明還包括了編碼所述的酶或多肽的生物活性片段的分離的核酸，也可以是其 互補鏈。作為本發明的優選方式，可對各酶或多肽的編碼序列進行密碼子優化，以提高表達 效率。編碼酶或多肽的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR擴增的 方法獲得。在獲得了編碼所述的酶或多肽的生物活性片段的DNA序列之后，將其連入合適 的表達構建物（如表達載體）中，再轉入合適的宿主細胞。最后通過培養轉化后的宿主細 胞，得到所要的多肽。
[0055] 表達構建物及宿主
[0056] 本發明還包括了包含編碼所述酶或多肽的生物活性片段的核酸分子的表達構建 物。所述的表達構建物可包括一個或多個編碼所述酶或多肽的基因表達盒，還可包含與所 述核酸分子的序列操作性相連的表達調控序列，以便于多肽的表達。所述的表達調控序列 的設計是本領域公知的。表達調控序列中，根據不同的需要，可以應用誘導型或組成型的啟 動子。例如，誘導型的啟動子可實現更可控的多肽表達以及化合物生產，有利于工業化應 用。
[0057] 作為本發明的優選方式，提供了一種表達構建物，其包括以下酶的基因表達盒：羧 酸還原酶的表達盒，醛還原酶的表達盒；較佳地，還包括：酯水解酶的表達盒；更佳地，該表 達質粒中還包括：EntD的表達盒。
[0058] 表達構建物的建立目前已經是本領域技術人員熟悉的技術。因此，在得知了所需 選擇的酶或多肽之后，本領域技術人員易于進行表達構建物的建立。編碼酶或多肽的基因 序列可以被插入到不同的表達構建物（如表達載體）中，也可以被插入到同一表達構建物 中，只要在轉入到細胞后酶或多肽能夠被有效地表達即可。
[0059] 此外，含有編碼所述酶或多肽的生物活性片段核酸序列的重組細胞也包括在本發 明中。該"細胞"包括原核細胞和真核細胞。常用的原核細胞包括大腸桿菌、枯草桿菌等； 常用的真核細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。作為本發明的優選方式，所述的 細胞是原核細胞，更佳地是大腸桿菌細胞；例如，所述大腸桿菌是W3110。
[0060] 用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為 原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用例如CaCl 2S MgCl2等方法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進 行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯 微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
[0061] 獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的酶或多肽。根據 所用的宿主細胞，在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。在培養的適當階段加入底物，來 實現脂肪醇的生產。
[0062] 生產方法
[0063] 本發明提供了一種制備脂肪醇的方法，包括：以脂肪酸為底物，利用羧酸還原酶將 脂肪酸轉化為脂肪醛；利用醛還原酶將脂肪醛轉化為脂肪醇。較佳地，所述的脂肪酸如下獲 得：以脂肪酸酯為底物，利用酯水解酶將脂肪酸酯轉化為脂肪酸。
[0064] 作為本發明的優選方式，提供了一種發酵法制備脂肪醇的方法，所述方法包括： 培養所述的重組的細胞，使之產生羧酸還原酶、醛還原酶，以及可選的酯水解酶或EntD，并 在培養體系中添加脂肪酸或脂肪酸酯作為反應底物，從而獲得脂肪醇。作為本發明的優 選方式，采用大腸桿菌進行重組表達所述的酶或多肽，重組細胞的培養條件是33±2°C， pH6. 8±0. 2,溶氧30% ±20%，通風量4±2vvm。當應用大腸桿菌作為表達宿主時，采用 IPTG進行誘導酶或多肽的表達。
[0065] 在獲得反應產物后，可以采用本領域已知的方法將脂肪醇從反應液（發酵液）中 分離出來。一種較為優選的方法如圖3所示。
[0066] 在本發明的較佳實施例中，列舉了生物催化9-癸烯酸甲酯生成9-癸烯醇的方法， 通過酯水解酶將底物水解為9-癸烯酸（9-DA)，然后通過羧酸還原酶直接將9-癸烯酸還原 為9-癸烯醛，最后通過醛還原酶還原9-癸烯醛為9-癸烯醇。在這個過程中，不飽和C = C雙鍵始終沒有變化，不受到這些酶的影響而保留。
[0067] 實施例中，盡管主要以生產9-癸烯醇作為舉例，但是應理解，其它飽和或不飽和 的脂肪酸酯或脂肪酸為底物來生產相應的脂肪醇也是可以的。例如用9,12-二烯十三酸甲 酯生成9,12-二烯十三酸、9,12-二烯十三醛、9,12-二烯十三醇。
[0068] 本發明采用生物法生產脂肪醇，其優勢是選擇性還原，可以在不影響C = C雙鍵的 情況下選擇性的還原羧酸基團，具有100 %的選擇性。與化學法相比，生物催化反應條件更 加溫和，不使用重金屬以及有機溶劑，是綠色環保的新方法，具有無可比擬的優勢。
[0069] 本發明的方法，通過提供一種新的綠色環保的生物方法來合成不飽和脂肪醇，同 時降低不飽和脂肪醇的制造成本以獲得工業上的應用。
[0070] 試劑盒
[0071] 基于本發明的方法改進，還提供了一種用于制備脂肪醇的試劑盒，所述的試劑盒 中包括：包含有羧酸還原酶的表達盒、醛還原酶的表達盒、酯水解酶的表達盒的表達構建物 或細胞；較佳地，所述的表達構建物或細胞還包含酯水解酶的表達盒；更佳地，所述的表達 構建物或細胞還包含EntD的表達盒。各表達盒可被串聯于一個表達構建物（如表達載體） 上，也可分別位于不同的表達構建物（如表達載體）上。各表達盒可存在于一個表達宿主 (細胞）中，也可存在于不同的表達宿主（細胞）中。
[0072] 此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書，以說明各材料的使用方法、反應順 序，便于本領域技術人員使用。
[0073] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0074] 實施例 1、構建質粒 pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD
[0075] 根據 SEQ ID N0:l、3、5,合成 MsCAR 基因片段（SEQ ID N0:l)、AlrA 基因片段（SEQ ID NO: 3)和Lea E7基因片段（SEQ ID NO: 5中第97-1713位），分別連入pUC57載體（蘇 州金唯智生物技術有限公司），分別獲得質粒pUC57-MsCAR、pUC57-AlrA和pUC57-Lc a E7。
[0076] 利用PCR方法分別從質粒pUC57-MsCAR和pUC57-AlrA上擴增基因 MsCAR和AlrA， 引物見表1。兩基因擴增產物分別帶酶切位點Ncol/Xhol和XhoI/BamHI，將兩基因擴增產 物分別進行酶切，回收后的片段與NcoI/BamHI雙酶切的質粒pEZ07 (通過轉移pTrc99A的 Laclq基因和pTre啟動子片段到pCL1920質粒的LaeZ α基因前獲得pEZ07,克隆pTrc99A 的引物為 GGCATCCGCTTACAGACA 和 TTGTCGGTGAACGCTCTCCTGA。pTrc99A 和 pCL1920 都獲自 Biovector中國質粒載體菌株細胞基因保藏中心）一起通過T4 DNA連接酶進行連接，并轉 化大腸桿菌DH5 α完成重組質粒pEZ07-MsCAR-AlrA的構建。
[0077] 然后，利用PCR方法從質粒pUC57_Lc α E7上擴增基因 Lc α E7,其兩端均分別帶有 限制性酶切位點EcoRI/Hindlll，將兩基因分別進行酶切，回收后的片段與EcoRI/Hindlll 雙酶切的質粒pEZ07-MsCAR-AlrA -起通過T4 DNA連接酶進行連接，并轉化大腸桿菌 DH5 α，完成重組質粒 pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc α E7 的構建。
[0078] 以大腸桿菌W3110基因組為模板，擴增基因 EntD (SEQ ID Ν0:7)，擴增引物為 EntD-BamHI-F和 EntD-EcoRI-R，將擴增得到的 EntD 片段與質粒pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc α E7 分別用相同的限制性內切酶BamHI、EcoRI進行酶切，回收后通過Τ4 DNA連接酶進行連接， 完成pEZ07-MsCAR-AlrA-LcaE7-EntD的構建，如圖1。啟動子為Tre，每個基因前都設置 rbs位點（序列為AAGGAG)用于蛋白轉錄。獲得的質粒pEZ07-MsCAR-AlrA-LcaE7-EntD轉 化大腸桿菌，獲得重組菌株 pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110。
[0079] 表1、重組菌株構建引物表
[0082] 實施例2、通過重組菌株pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110將9-癸烯酸甲酯 轉化為9-癸烯醇
[0083] 通過在生產宿主中外源性表達酯水解酶、羧酸還原酶和醛還原酶將底物脂肪酸甲 酯（具體為9-癸烯酸甲酯）轉化為脂肪醇（具體為9-癸烯醇），反應式如下：
[0085] 具體來說，將質粒pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD轉化入大腸桿菌W3110,在添 加100mg/L壯觀霉素的LB板中挑選相應的轉化子。將pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/ W3110的轉化子接種于3mL添加100mg/L壯觀霉素的LB+1%甘油的培養基中，然后在培養 箱內33°C培養過夜。從過夜的培養基中取100uL轉移到50mL(2%接種量）同樣培養基的 250mL燒瓶中，然后在培養箱內33°C培養至0D600達到0. 5~0. 6,添加終濃度為ImM的 IPTG，同時添加400uL純的9-癸烯酸甲酯（終濃度為7g/L)，在誘導后3小時，18小時時分 別取發酵液400uL于2mL離心管中，加入800uL的4-甲基-2-戊酮，將離心管置于渦旋振蕩 器上劇烈震蕩，從發酵液中萃取出反應剩余的9-癸烯酸甲酯，中間產物9-癸烯酸，9-癸烯 醛和產物9-癸烯醇，震蕩30分鐘后將離心管在12000rpm離心1分鐘，取上層4-甲基-2-戊 酮萃取層，轉移到2mL新離心管中，加入無水硫酸鈉干燥，然后繼續在12000rpm離心1分 鐘，取上清4-甲基-2戊酮溶液進行GC檢測。GC檢測方法具體為：進樣口 280°C，分流比 10:1，流速3ml每分鐘，柱溫起始100°C，25 °C每分鐘升至246 °C，30 °C每分鐘升至290 °C并 保留2分鐘，檢測器300°C。本菌株在上述培養條件下9-癸烯醇在3h時轉化率為19. 0%， 18h時轉化率為94. 9%。
[0086]
[0087] 經測定，反應過程中，不飽和C = C雙鍵始終沒有變化，并不受到所表達的酶或表 達體系的影響。
[0088] 實施例3、在3L發酵罐中轉化9-癸烯酸甲酯為9-癸烯醇
[0089] 所用培養基如表2所示。
[0090] 表2、以9-癸烯酸甲酯為底物的發酵培養基成分
[0091]
[0092] 挑取活化的單菌落（重組菌株pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110)接入種子 培養基中，200rpm，30°C培養過夜；按5%的接種量接種到含有0. 95L發酵培養基的3L發酵 罐中，發酵參數控制為：溫度33°C，pH6. 8,溶氧30%，通風量4vvm，攪拌轉速與溶氧偶聯，通 過流加補料培養基控制發酵液中甘油濃度為4-8g/L ;發酵2h后加入IPTG (終濃度為ImM) 誘導，誘導lh開始流加9-癸稀酸甲酯，流加周期為每7~8min流加 ls(流速為10mL/min)， 發酵過程如圖2。發酵68h，共添加底物100g，轉化率95%。
[0093] 實施例4、9_癸烯醇的分離和提純
[0094] 將發酵罐中發酵液轉移到5L四口瓶中于80°C加熱2小時，然后用濃鹽酸調節至 pH = 2. 0,加入等體積的乙酸乙酯，攪拌器充分攪拌萃取后7000rpm離心10分鐘，倒出乙 酸乙酯和水相，分液漏斗分離水相和乙酸乙酯相，離心沉淀用乙酸乙酯重懸再攪拌萃取， 7000rpm離心10分鐘后倒出乙酸乙酯層，加入新的乙酸乙酯重復上述步驟2次，然后合并乙 酸乙酯萃取液，旋蒸濃縮得到粗產品80g，再將粗產品進行油浴減壓精餾，外溫105°C，得到 純度大于99%的9-癸稀醇65g。
[0095] 實施例5、通過重組菌株pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110將9-癸烯酸轉化 為9-癸烯醇
[0096] 將 pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110(該發酵不需要 Lc α E7,但該基因的存 在沒有影響）的轉化子接種于3mL添加100mg/L壯觀霉素的LB+1%甘油的培養基中，然后 在培養箱內33°C和250rpm培養過夜。從過夜的培養基中取100uL轉移到50mL(2%接種量） 同樣培養基的250mL燒瓶中，然后在培養箱內33°C和250rpm培養至0D600達到0. 5~0. 6， 添加終濃度為ImM的IPTG，同時添加100uL純的9-癸烯酸（終濃度為1. 8g/L)，在誘導后 3小時，18小時時分別取發酵液400uL于2mL離心管中，加入800uL的4-甲基-2-戊酮，將 離心管置于渦旋振蕩器上劇烈震蕩從發酵液中萃取出反應剩余的9-癸烯酸，中間體9-癸 烯醛，和產物9-癸烯醇，震蕩30分鐘后在12000rpm離心1分鐘，取上層4-甲基-2-戊酮 有機層，轉移到2mL新離心管中，加入無水硫酸鈉干燥，12000rpm，1分鐘離心，取上清4-甲 基-2戊酮有機溶液進行GC檢測。GC檢測方法具體為：進樣口 280°C，分流比10:1，流速3ml 每分鐘，柱溫起始100 °C，25 °C每分鐘升至246 °C，30 °C每分鐘升至290 °C并保留2分鐘，檢測 器300°C。本菌株在上述培養條件下9-癸烯醇在3h時轉化率為18. 2%，18h時轉化率為 93. 6%〇
[0097] 實施例6、在3L發酵罐中轉化9-癸烯酸為9-癸烯醇
[0098] 所用培養基如表3所示。
[0099] 表3、以9-癸稀酸為底物的發酵培養基成分
[0100]
[0101] 挑取活化的單菌落（重組菌株pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110,該發酵不 需要Lc α E7,但該基因的存在沒有影響）接入種子培養基中，200rpm，30°C培養過夜；按5% 的接種量接種到〇. 95L發酵培養基的3L發酵罐，發酵參數控制為：溫度33°C，pH6. 8,溶氧 30%，通風量2vvm，攪拌轉速與溶氧偶聯，通過流加補料培養基控制發酵液中甘油濃度為 4-8g/L ;在發酵罐中生長至0D600達到0. 5~0. 6,添加終濃度為ImM的IPTG，同時開始流 加9-癸稀酸，流加周期為每7~8min流加 Is (流速為10mL/min)，發酵24h，共添加底物 20區，轉化率98%。
[0102] 實施例 7、通過重組菌株 pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110 將 9,12-二烯 十三酸甲酯轉化為9,12-二烯十三碳-1-醇
[0103] 將 pEZ07-MsCAR-AlrA-Lc a E7-EntD/W3110 的轉化子接種于 3mL 添加 lOOmg/L 壯觀霉素的TB培養基中，然后在培養箱內33 °C和250rpm培養過夜。從過夜的培養基中 取100uL轉移到50mL(2%接種量）同樣培養基的250mL燒瓶中，然后在培養箱內33°C和 250rpm培養至0D600達到0. 5~0. 6,添加終濃度為ImM的IPTG，同時添加200uL純的9， 12-二烯十三酸甲酯（終濃度為4g/L)，在誘導后3小時，18小時時分別取發酵液400uL于 2mL離心管中，加入800uL的4-甲基-2-戊酮，將離心管置于渦旋振蕩器上劇烈震蕩30分 鐘，然后在12000rpm離心1分鐘，取上層4-甲基-2-戊酮萃取層，轉移到2mL新離心管中， 加入無水硫酸鈉干燥，12000rpm，1分鐘離心，取上清4-甲基-2戊酮溶液用進行GC檢測。 GC檢測方法具體為：進樣口 280°C，分流比10:1，流速3ml每分鐘，柱溫起始100°C，25°C每 分鐘升至246°C，30°C每分鐘升至290°C并保留2分鐘，檢測器300°C。
[0104] 結果，本菌株在18h時轉化率為90%。
[0105] 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【主權項】
1. 一種制備脂肪醇的方法，其特征在于，所述方法包括： 以脂肪酸為底物，利用羧酸還原酶將脂肪酸轉化為脂肪醛；利用醛還原酶將脂肪醛轉 化為脂肪醇。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酸如下獲得：以脂肪酸酯為底 物，利用酯水解酶將脂肪酸酯轉化為脂肪酸。3. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于， 所述的羧酸還原酶包括：MsCAR，MmCAR或NsCAR ; 所述的醛還原酶包括：AlrA或YjgB ; 所述的酯水解酶包括：CALB，HDE，Lc α E7, BioH，YbaC或TesA。4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括：利用EntD或Sfp促進羧酸還原酶 的活性。5. 如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的MsCAR具有SEQ ID NO: 2所示的 氨基酸序列；和/或 所述的AlrA具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列；和/或 所述的Lea E7具有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列或SEQ ID NO: 6中第33-570位所 示的氨基酸序列；優選地是氨基酸序列如SEQ ID N0:6中第33-570位所示的截短體；和/ 或 所述的EntD具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。6. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，羧酸還原酶的表達盒、醛還原酶的表達 盒被串聯于一個表達質粒中；$父佳地，該表達質粒中還串聯有酯水解酶的表達盒；更佳地， 該表達質粒中還串聯有EntD的表達盒。7. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酸為不飽和脂肪酸，所述的 脂肪醇為不飽和脂肪醇，所述的脂肪醛為不飽和脂肪醛，所述的脂肪酸酯為不飽和脂肪酸 酯；或 所述的脂肪酸為飽和脂肪酸，所述的脂肪醇為飽和脂肪醇，所述的脂肪醛為飽和脂肪 醛，所述的脂肪酸酯為飽和脂肪酸酯。8. -種重組的表達構建物，其特征在于，所述的表達構建物中包括：羧酸還原酶的表 達盒，醛還原酶的表達盒；較佳地，該表達質粒中還包括：酯水解酶的表達盒；更佳地，該表 達質粒中還包括：EntD的表達盒。9. 一種重組的細胞，其特征在于，所述的細胞中包括權利要求8所述的表達構建物。10. -種發酵法制備脂肪醇的方法，其特征在于，所述方法包括：培養權利要求9所述 的重組的細胞，并在培養體系中添加脂肪酸或脂肪酸酯作為反應底物，從而獲得脂肪醇。11. 一種用于制備脂肪醇的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中包括： 包含有羧酸還原酶的表達盒、醛還原酶的表達盒、酯水解酶的表達盒的表達構建物或 細胞；較佳地，所述的表達構建物或細胞還包含酯水解酶的表達盒；更佳地，所述的表達構 建物或細胞還包含EntD的表達盒。
【文檔編號】C12P7/04GK105985987SQ201510093004
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月2日
【發明人】謝新開, 胡志浩, 江君君, 田峰, 李曉輝, 杜好勉
【申請人】蘇州安捷生物科技有限公司, 蘇州漢酶生物技術有限公司