誘發微藻細胞自解的活性物質及其制造方法

誘發微藻細胞自解的活性物質及其制造方法
【專利摘要】本發明提供一種誘發微藻細胞自解的活性物質及其制造方法，包括：在培養液中接種一芽胞桿菌(Bacillus)屬的菌株，獲得菌體懸浮液；將在該菌體懸浮液中的芽胞桿菌屬的菌株培養至少至生長穩定期，至該芽胞桿菌屬的菌株于該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清的狀態；以及在該芽胞桿菌屬的菌株于該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清之后，將該菌體懸浮液進行減壓蒸餾程序，以獲得活性溶液，其中該活性溶液中含有誘發微藻細胞自解的活性物質。DSM 2980720141211
【專利說明】
誘發微藻細胞自解的活性物質及其制造方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種誘發微藻細胞自解的活性物質與其制造方法，以及此誘發微藻細 胞自解的活性物質的應用。
【背景技術】
[0002] 為了解決目前全球因過度使用化石能源所造成溫室效應及石油利用成本提升的 問題，將生質料源轉化為能源方式已被視為取代傳統化石燃料的途徑之一。而在生質能源 技術開發中，微藻生質柴油是受到矚目的研究方向。
[0003] 不同于目前產業界主要將微藻應用于食品、保健、生物醫藥等高價產品，將微藻應 用于生質燃料產業雖然市場規模極大，但產品單價低，對于生產的成本與耗能更加著重。而 要將油脂從微藻細胞中取出作為生質燃料，必需先破壞微藻細胞，但此程序往往是相當耗 能，進而造成成本提尚。
[0004] 在過去的研究中發現，以傳統機械力破壞微藻細胞壁需要消耗微藻細胞所含總能 量的約30%，成為微藻生質燃料產業化的一大阻礙。而化學破壁方法因為需使用化學藥劑， 所以在生物細胞破壞的同時，也可能造成胞內產物的破壞，而不利于后續產物回收使用，再 者化學破壁也需額外的攪拌動力進而使成本提高。
[0005] 有鑒于傳統機械破壁技術處理微藻細胞這類高含水生質物所消耗的能量太大，不 符合生質燃料產業所需，與化學破壁易造成胞內產物破壞且仍需額外攪拌動力，因此目前 亟需一種新穎的低能耗、低成本的微藻破壁技術，以期微藻生質能可邁向市場化。

【發明內容】

[0006] 本發明提供一種誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，包括：在培養液中接 種一芽胞桿菌（Bacillus)屬的菌株以獲得菌體懸浮液；將在該菌體懸浮液中的芽胞桿菌 屬的菌株培養至少至生長穩定期（stationary phase)，至該芽胞桿菌屬的菌株于該菌體懸 浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清的狀態；以及在該芽胞桿菌屬的菌株于該菌體懸 浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清之后，將該菌體懸浮液進行減壓蒸餾程序，以獲 得活性溶液，其中該活性溶液中含有誘發微藻細胞自解的活性物質。
[0007] 本發明也提供一種誘發微藻細胞自解的活性物質，其由包括下列步驟的方法所獲 得：在培養液中接種一芽胞桿菌屬的菌株以獲得菌體懸浮液；將在該菌體懸浮液中的芽胞 桿菌屬的菌株培養至少至生長穩定期，至該芽胞桿菌屬的菌株于該菌體懸浮液中形成聚集 且該菌體懸浮液變為澄清的狀態；以及在該芽胞桿菌屬的菌株于該菌體懸浮液中形成聚集 且該菌體懸浮液變為澄清之后，將該菌體懸浮液進行減壓蒸餾程序，以獲得活性溶液，其中 該活性溶液中含有誘發微藻細胞自解的活性物質。
[0008] 本發明還提供一種誘發微藻細胞自解的方法，包括：將微藻細胞與前述的誘發微 藻細胞自解的活性物質接觸，以誘發微藻細胞自解。
[0009] 本發明更提供一種誘發微藻細胞自解的方法，包括：在培養液中接種一芽胞桿菌 屬的菌株接種以獲得菌體懸浮液；將在該菌體懸浮液中的菌該芽胞桿菌屬的菌株培養至少 至生長穩定期；在該芽胞桿菌屬的菌株于該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄 清之后，將該菌體懸浮液取出；將取出的菌體懸浮液進行減壓蒸餾程序，以獲得活性溶液， 其中該活性溶液中含有誘發微藻細胞自解的活性物質；將該微藻細胞與含該活性溶液混合 以形成一混合液；以及將該混合液靜置，以使該微藻細胞自解并沉降。
【附圖說明】
[0010] 圖 1 顯不蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis) ITRI-G1 (2014 年 12 月 11日保藏于德國微生物菌種保藏中心，萊布尼茨研究院DSMZ，Inhoffenstr. 7B，D-38124 Braunschweig，德國，保藏編號：DSM 29807)培養液的蒸餾液與殘留液的破胞活性；
[0011] 圖2顯示不同的本發明活性物質的處理時間對于微藻破胞的影響；
[0012] 圖3A顯示不同的本發明活性物質的處理時間對于小球藻破胞的影響；
[0013] 圖3B顯示不同的本發明活性物質的處理時間對于微星藻破胞的影響；
[0014] 圖3C顯示不同的本發明活性物質的處理時間對于擬球藻破胞的影響；
[0015] 圖4A顯示冷凍對于本發明誘發微藻細胞自解的活性物質的影響；
[0016] 圖4B顯示加熱對于本發明經冷凍的誘發微藻細胞自解的活性物質的影響；
[0017] 圖5顯示回收的本發明活性物質對于促進微藻油脂萃取的功效；
[0018] 圖6顯示測試攪拌對于活性物質誘發微藻破胞的影響的結果；
[0019] 圖7顯示不同的細菌培養時間所獲得的培養液的蒸餾液的微藻破胞效功效；
[0020] 圖8顯示適用于獲得誘發微藻細胞自解的活性物質的減壓蒸餾的溫度及壓力范 圍；
[0021] 圖9顯示本發明的活性物質溶液的高效液相色譜（HPLC)的結果；
[0022] 圖10A顯示通過將上述高效液相色譜所獲得的具有破胞活性的的區段產物進行 氣相色譜于第5. 9分鐘所獲得的樣本的質譜分析（mass spectrometry);以及
[0023] 圖10B顯示通過將上述高效液相色譜所獲得的具有破胞活性的的區段產物進行 氣相色譜于第8. 5分鐘所獲得的樣本的質譜分析。
【具體實施方式】
[0024] 在本發明一實施例中，本發明提供一種誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方 法。而本發明的誘發微藻細胞自解的活性物質，具有在微藻細胞內誘發一連串生化反應而 使其自行裂解的功效。
[0025] 于此所敘述的微藻細胞，可為一單細胞藻類微生物，具有細胞壁外殼保護。在 一實施例中，上述微藻細胞的例子可包括，但不限于，小球藻（Chlorella sp.)、擬球藻 (Nannochloropsis sp.)、扁藻（Tetraselmis sp.)、等鞭金藻（Isochrysis galbana)與杜 氏藻（Dunaliella sp.)等。
[0026] 本發明的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，可包括下列步驟，但不限于 此。
[0027] 首先，在培養液中接種一芽胞桿菌（Bacillus)屬的菌株以獲得菌體懸浮液。
[0028] 上述芽胞桿菌屬的菌株的例子可包括，蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis)等，但不限于此。上述蘇云金芽胞桿菌可為在臺灣食品工業發展研究所生 物資源保存及研究中心保藏的蘇云金芽胞桿菌BCRC 14683 (新竹市食品路331號，30061)， 或保藏編號為DSM 29807的蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis) ITRI-G1(德國微 生物菌種保藏中心，萊布尼茨研究院DSMZ，Inhoffenstr. 7B, D_38124Braunschweig)。在一 實施例中，于本發明的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法中所使用的芽胞桿菌屬的 菌株可為保藏編號為DSM 29807的蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1。
[0029] 又，上述培養液的成分并無特殊限制。在一實施例中，培養液的成分可包括蛋白胨 與酵母菌提取物等，但不限于此。上述蛋白胨于培養液中的濃度可為約l_5g/L，又，上述酵 母菌提取物于培養液中的濃度可為約〇. 1-0. 5g/L，但不限于此。在一特定實施例中，培養液 的成分可包括2g/L蛋白胨與0. 2g/L酵母菌提取物。
[0030] 接著，將在菌體懸浮液中的芽胞桿菌屬的菌株培養至少至生長穩定期，至芽胞桿 菌屬的菌株于菌體懸浮液中形成聚集且菌體懸浮液變為澄清的狀態。在一實施例中，將在 菌體懸浮液中的芽胞桿菌屬的菌株培養約2-3天，可使芽胞桿菌屬的菌株于菌體懸浮液中 形成聚集且菌體懸浮液變為澄清。在一特定實施例中，培養芽胞桿菌屬的菌株約2天，可使 芽胞桿菌屬的菌株于菌體懸浮液中形成聚集且菌體懸浮液變為澄清。
[0031 ] 又，培養上述芽胞桿菌屬的菌株的溫度為約20_40°C，但不限于此。在一實施例中， 將上述芽胞桿菌屬的菌株培養于28°C。
[0032] 然后，在芽胞桿菌屬的菌株于菌體懸浮液中形成聚集且菌體懸浮液變為澄清之 后，將菌體懸浮液進行減壓蒸餾程序，以獲得活性溶液，而活性溶液中則含有誘發微藻細胞 自解的活性物質。
[0033] 上述減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約40_90°C，但不限于此。在一實施例中可為約 40 °C、約50 °C、約60 °C、約75 °C或約90 °C。在一特定實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可 為約50°C。又，上述減壓蒸餾程序的壓力為約65-550hPa，但不限于此。在一實施例中可為 約80hPa、約llOhPa、約210hPa、約295hPa或約490hPa。在一特定實施例中，減壓蒸餾程序 的壓力可為約llOhPa。
[0034] 在一實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約40_90°C，而減壓蒸餾程序的壓力 為可約65-550hPa。在另一定實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約40°C，而減壓蒸 餾程序的壓力為可約65-95hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約50°C，而減壓蒸餾程序 的壓力為可約105-155hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約60°C，而減壓蒸餾程序的壓 力為可約175-245hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約75°C，而減壓蒸餾程序的壓力為 可約245-345hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約90°C，而減壓蒸餾程序的壓力為可約 430-550hPa。且，在一特定實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約50°C，而減壓蒸餾程 序的壓力為可約llOhPa。
[0035] 在一實施例中，上述本發明的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法可進一步 包括，將所獲得的活性溶液以高效液相色譜分離出誘發微藻細胞自解的活性物質的步驟。
[0036] 在另一實施例中，上述本發明的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，可進 一步包括，將所獲得的含誘發微藻細胞自解的活性物質的活性溶液加熱，以避免其中的誘 發微藻細胞自解的活性物質聚集而降低活性的步驟。活性溶液加熱的溫度可為約50_90°C， 而在一實施例中為約60°C。又，活性溶液加熱的時間可為約2-10小時，而在一實施例中為 約8小時。在一實施例中，活性溶液加熱的溫度可為約60-80°C，而活性溶液加熱的時間可 為約6-8小時。在一特定實施例中，活性溶液加熱的溫度可為約60、70或80°C，而活性溶液 加熱的時間可為約8小時。
[0037] 在另一實施例中，本發明也提供一種誘發微藻細胞自解的活性物質。本發明的誘 發微藻細胞自解的活性物質可通過任何上述本發明的誘發微藻細胞自解的活性物質的制 造方法來獲得。
[0038] 在又另一實施例中，本發明還提供一種誘發微藻細胞自解的方法。于此所述本發 明的誘發微藻細胞自解的方法，可包括下列步驟，但不限于此。
[0039] 首先，將微藻細胞與通過任何上述本發明的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造 方法所獲得的誘發微藻細胞自解的活性物質接觸，以誘發微藻細胞自解。
[0040] 于此所述的微藻細胞為一單細胞藻類微生物，具有細胞壁外殼保護，例如小球藻、 擬球藻、扁藻、鞭金藻或杜氏藻等。在一實施例中，微藻細胞為新鮮存活狀態的微藻細胞。
[0041] 將微藻細胞與本發明誘發微藻細胞自解的活性物質接觸的步驟并無特別限制，僅 需使微藻細胞與誘發微藻細胞自解的活性物質實際接觸即可，例如，可于含微藻細胞的溶 液中直接添加誘發微藻細胞自解的活性物質本身，或將微藻細胞與含誘發微藻細胞自解的 活性物質的活性溶液混合。
[0042] 而在一實施例中，將微藻細胞與上述本發明的誘發微藻細胞自解的活性物質接觸 的步驟，可包括，但不限于，將微藻細胞與含誘發微藻細胞自解的活性物質的活性溶液混合 以形成一混合液，之后將混合液靜置或將混合液持續攪拌后靜置，以使微藻細胞自解并沉 降。又，微藻細胞可占上述混合液的約4-50wt%，例如10wt%。
[0043]由于本發明的誘發微藻細胞自解的活性物質，具有誘發微藻細胞內一連串生化反 應而使其自行裂解的功效，且細胞裂解是由細胞內的生化反應所導致，因此誘發微藻細胞 自解的方法對細胞外的攪拌質傳需求低，可在低攪拌條件下或甚至不須攪拌下進行。
[0044] 在一實施例中，將微藻細胞與上述本發明的誘發微藻細胞自解的活性物質接觸的 步驟，可包括，但不限于，將微藻細胞與含誘發微藻細胞自解的活性物質的活性溶液混合以 形成一混合液，之后將混合液靜置，以使微藻細胞自解并沉降。于此實施例中，可將混合物 靜置約5-30小時，例如約8、12、24小時。又，混合物的靜置溫度并無特殊限制。在一實施 例中，可將混合物靜置于室溫。又，混合物的靜置溫度并無特殊限制。在一實施例中，可將 混合物靜置于室溫。
[0045] 在一實施例中，上述本發明的誘發微藻細胞自解的方法，還可進一步包括，在將微 藻細胞與通過任何上述本發明的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法所獲得的誘發 微藻細胞自解的活性物質接觸之前，先將含誘發微藻細胞自解的活性物質的活性溶液混合 進行加熱，以避免其中的誘發微藻細胞自解的活性物質聚集而降低活性。而將含誘發微藻 細胞自解的活性物質的活性溶液加熱的溫度可為約50-90°C，例如，60°C，但不限于此。又， 將含誘發微藻細胞自解的活性物質的活性溶液加熱的時間可為約2-10小時，例如，8小時， 但不限于此。在一實施例中，活性溶液加熱的溫度為約60-80°C，而加熱的時間為約6-8小 時。在一特定實施例中，活性溶液加熱的溫度為約60、70或80°C，而加熱的時間為約8小 時。
[0046] 在另一實施例中，上述本發明的誘發微藻細胞自解的方法，可進一步包括，在微藻 細胞自解并沉降之后，回收上述混合液的上清液，以回收于上清液中的誘發微藻細胞自解 的活性物質。
[0047] 于此實施例中，還可進一步包括，將所回收的上清液進行加熱，以避免其中的誘發 微藻細胞自解的活性物質聚集而降低活性的步驟。而將含將所回收的上清液加熱的溫度可 為約50-90°C，例如，60°C，但不限于此。又，將所回收的上清液加熱的時間可為約2-10小 時，例如，8小時，但不限于此。在一實施例中，將所回收的上清液加熱的溫度為約60-80°C， 而加熱的時間為約6-8小時。在一特定實施例中，將所回收的上清液加熱的溫度為約60、70 或80°C，而加熱的時間為約8小時。
[0048] 在又另一實施例中，本發明更提供另一種誘發微藻細胞自解的方法。于此所述本 發明的誘發微藻細胞自解的方法，可包括，但不限于下方所述的步驟。
[0049] 首先，在培養液中接種一芽胞桿菌屬的菌株接種以獲得菌體懸浮液。
[0050] 適用于此所述的本發明誘發微藻細胞自解的方法中使用的芽胞桿菌屬的菌株，可 包括，但不限于，蘇云金芽胞桿菌。上述蘇云金芽胞桿菌的例子可包括，蘇云金芽胞桿菌 BCRC 14683與保藏編號為DSM 29807的蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1等，但不限于此。在一實 施例中，于本發明的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法中所使用的芽胞桿菌屬的菌 株，可為保藏編號為DSM 29807的蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1。
[0051] 而，適合在于此所述的本發明誘發微藻細胞自解的方法中使用的培養液并無特殊 限制。在一實施例中，于此所述的本發明誘發微藻細胞自解的方法中所使用的培養液為適 合芽胞桿菌屬的菌株生長的培養液。在另一實施例中，培養液的成分可包括蛋白胨與酵母 菌提取物等，但不限于此。上述蛋白胨于培養液中的濃度可為約l_5g/L，又，上述酵母菌提 取物于培養液中的濃度可為約〇. 1-0. 5g/L，但不限于此。在一特定實施例中，培養液的成分 可包括2g/L蛋白胨與0. 2g/L酵母菌提取物。
[0052] 然后，將在菌體懸浮液中的芽胞桿菌屬的菌株培養至少至生長穩定期，至芽胞桿 菌屬的菌株于菌體懸浮液中形成聚集且菌體懸浮液變為澄清的狀態。在一實施例中，將在 菌體懸浮液中的芽胞桿菌屬的菌株培養約2-3天，可使芽胞桿菌屬的菌株于菌體懸浮液中 形成聚集且菌體懸浮液變為澄清。在一特定實施例中，培養芽胞桿菌屬的菌株約2天，可使 芽胞桿菌屬的菌株于菌體懸浮液中形成聚集且菌體懸浮液變為澄清。又，培養芽胞桿菌屬 的菌株的溫度為約20-40°C，例如約28°C，但不限于此。
[0053] 再來，在芽胞桿菌屬的菌株于菌體懸浮液中形成聚集且菌體懸浮液變為澄清之 后，將菌體懸浮液進行減壓蒸餾程序，以獲得活性溶液，而活性溶液中則含有誘發微藻細胞 自解的活性物質。
[0054] 適合獲得上述活性溶液的減壓蒸餾程序所采用的蒸餾溫度與壓力，如下所述。減 壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約40-90°C，例如約40°C、約50°C、約60°C、約75°C、約90°C等， 但不限于此，在一實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約50°C。又，上述減壓蒸餾程序 的壓力為可約65-550hPa，例如在一實施例中可為約80hPa、約110hPa、約210hPa、約295hPa 或約550hPa。在一特定實施例中，減壓蒸餾程序的壓力可為約llOhPa。
[0055] 在一實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約40_90°C，而減壓蒸餾程序的壓力 為可約65-550hPa。在另一定實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約40°C，而減壓蒸 餾程序的壓力為可約65-95hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約50°C，而減壓蒸餾程序 的壓力為可約105-155hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約60°C，而減壓蒸餾程序的壓 力為可約175-245hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約75°C，而減壓蒸餾程序的壓力為 可約245-345hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約90°C，而減壓蒸餾程序的壓力為可約 430-550hPa。且，在一特定實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約50°C，而減壓蒸餾程 序的壓力為可約llOhPa。
[0056] 接著，將微藻細胞與含誘發微藻細胞自解的活性物質的活性溶液混合以形成一混 合液。微藻細胞可占上述混合液的約4_50wt %，例如10wt %。于此所述的微藻細胞為單細 胞藻類微生物，具有細胞壁外殼保護，例如小球藻、擬球藻、扁藻、等鞭金藻、杜氏藻等。在一 實施例中，微藻細胞為新鮮存活狀態的微藻細胞。
[0057] 最后，將混合液靜置，以使微藻細胞自解并沉降。可將上述混合液靜置約5-30小 時，例如約8、12與24小時。在一實施例中，將上述混合液靜置約8-24小時。在一特定實 施例中，則將上述混合液靜置約8、12或24小時。
[0058] 又，在一實施例中，于此所述的本發明誘發微藻細胞自解的方法，可進一步包括， 在將微藻細胞與前述活性溶液混合之前，將所獲得的活性溶液以高效液相色譜分離出誘發 微藻細胞自解的活性物質的步驟。
[0059] 另外，在一實施例中，于此所述的本發明的誘發微藻細胞自解的方法，可進一步包 括，在將微藻細胞與前述活性溶液混合之前，先將前述活性溶液混合進行加熱，以避免其中 的誘發微藻細胞自解的活性物質聚集而降低活性。
[0060] 而將含誘發微藻細胞自解的活性物質的活性溶液加熱的溫度可為約50-90°C，例 如，60°C，但不限于此。又，將含誘發微藻細胞自解的活性物質的活性溶液加熱的時間可為 約2-10小時，例如，8小時，但不限于此。在一實施例中，活性溶液加熱的溫度為約60-80°C， 而加熱的時間為約6-8小時。在一特定實施例中，活性溶液加熱的溫度為約60、70或80°C， 而加熱的時間為約8小時。
[0061] 此外，在另一實施例中，于此所述的本發明的誘發微藻細胞自解的方法，也可進一 步包括，在微藻細胞自解并沉降之后，回收上述混合液的上清液，以回收于上清液中的誘發 微藻細胞自解的活性物質。
[0062] 而于此實施例中，還可進一步包括，將所回收的上清液進行加熱，以避免其中的誘 發微藻細胞自解的活性物質聚集而降低活性的步驟。而將含將所回收的上清液加熱的溫度 可為約50-90°C，例如，60°C，但不限于此。又，將所回收的上清液加熱的時間可為約2-10小 時，例如，8小時，但不限于此。在一實施例中，將所回收的上清液加熱的溫度為約60-80°C， 而加熱的時間為約6-8小時。在一特定實施例中，將所回收的上清液加熱的溫度為約60、70 或80°C，而加熱的時間為約8小時。
[0063] 通過本發明的誘發微藻細胞自解的方法，可只需將微藻細胞與含誘發微藻細胞自 解的活性物質的活性溶液混合后靜置，而不須進行攪拌及/或其他處理，即可完成微藻細 胞的破胞。
[0064] 又，于微藻細胞破胞完成后，于本發明的誘發微藻細胞自解的方法中所使用的誘 發微藻細胞自解的活性物質，也能輕易地被回收并繼續使用。因此，由此可知，本發明的誘 發微藻細胞自解的方法具有操作容易、節省能源與降低成本等多重優點，為一種新穎的低 耗能、低成本、可回收的微藻細胞破胞方法。
[0065] 實施例
[0066] 實施例1、誘發微藻細胞自解的活性物質的揮發性質的確認
[0067] 1.蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis) ITRI-G1 (保藏編號 DSM29807,德 國微生物菌種保藏中心，萊布尼茨研究院DSMZ，Inhoffenstr. 7B, D_38124Braunschweig) 的培養液的處理
[0068] (1)蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
[0069] 將蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示的培養液與培養條件進行培養
[0070] 培養液：2g/L蛋白胨+0· 2g/L酵母菌提取物
[0071] 培養條件：在150rpm的震蕩速率下，以28°C培養2天
[0072] 于蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成后，取300mL的培養液進行減壓蒸餾程序。在 不同蒸餾時間收集殘留液（未揮發部分），并于蒸餾2小時之時收集所有蒸餾液，減壓蒸餾 的條件如下所示：
[0073] 蒸餾溫度：50°C
[0074] 壓力：110hPa
[0075] 時間：2小時
[0076] 2.小球藻的破胞測試
[0077] 將新鮮的小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻懸浮液。接著將上方所得的殘 留液或蒸餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻于懸浮液的濃度為約l〇g/L。
[0078] 然后，測定懸浮液的280nm吸光值，以評估小球藻因細胞壁破壞而釋出的蛋白質 的量。結果如圖1所示。
[0079] 根據圖1可明確得知，隨蒸餾時間增加，殘留液的破胞活性越來越低，至蒸餾2小 時之時，殘留液幾乎完全沒有破胞活性。相對地，蒸餾液則顯示相當高的破胞活性。
[0080] 故，由上述可知，蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1所產生的誘發微藻細胞自解的活性物 質完全揮發且存在于蒸餾液中。
[0081] 實施例2、通過誘發微藻細胞自解的活性物質的小球藻的破胞測試
[0082] 1.誘發微藻細胞自解的活性物質的制備
[0083] (1)蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
[0084] 將蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示的培養液與培養條件進行培養
[0085] 培養液：2g/L蛋白胨+0· 2g/L酵母菌提取物
[0086] 培養條件：在150rpm的震蕩速率下，以28°C培養2天
[0087] (2)誘發微藻細胞自解的活性物質的分離純化
[0088] 于蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成后，取300mL的培養液通過減壓蒸餾程序進 行分離純化，并獲得l〇〇mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾的條件如下所示：
[0089] 蒸餾溫度：50°C
[0090] 壓力：110hPa
[0091] 時間：2小時。
[0092] 2.小球藻的破胞
[0093] 將新鮮的小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻懸浮液。接著將上方所得的蒸 餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻于懸浮液的濃度為約l〇g/L。
[0094] 然后，于不同時間點取出部分懸浮液以測定懸浮液的280nm吸光值，以評估小球 藻因細胞壁破壞而釋出的蛋白質的量。結果如圖2所示，其中測試1與測試2為重復實驗。
[0095] 根據圖2可明確得知，上方所獲得的蒸餾液，的確可使微藻破胞自解。
[0096] 實施例3、誘發微藻細胞自解的活性物質對于不同微藻的破胞功效
[0097] 1.誘發微藻細胞自解的活性物質的制備
[0098] (1)蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1與蘇云金芽胞桿菌BCRC 14683 (購自臺灣食品工業 發展研究所生物資源保存及研究中心）的培養
[0099] 分別將蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1與蘇云金芽胞桿菌BCRC 14683以下方所示的培 養液與培養條件進行培養
[0100] 培養液：2g/L蛋白胨+0. 2g/L酵母菌提取物
[0101] 培養條件：在150rpm的震蕩速率下，以28°C培養2天
[0102] (2)誘發微藻細胞自解的活性物質的分離純化
[0103] 于蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1或蘇云金芽胞桿菌BCRC 14683培養完成后，取300mL 的培養液通過減壓蒸餾程序進行分離純化，并獲得l〇〇mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾的條件如 下所示：
[0104] 蒸餾溫度：50 °C
[0105] 壓力：110hPa
[0106] 時間：2小時。
[0107] 2.微藻的破胞
[0108] 將新鮮的微藻調配為濃度為約150g/L的微藻懸浮液。接著將上方所得的蒸餾液 添加至微藻懸浮液中（控制組為將水添加至微藻懸浮液中），至微藻于懸浮液的濃度為約 5g/L。之后將懸浮液靜置24小時。獲自蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1的培養液的蒸餾液所測 試的微藻種類包括小球藻、微星藻以及擬球藻，而獲自蘇云金芽胞桿菌BCRC 14683的培養 液的蒸餾液所測試的微藻種類則包括小球藻以及微星藻。
[0109] 然后，于不同時間點取出部分懸浮液以測定懸浮液的280nm吸光值，以評估微藻 因細胞壁破壞而釋出的蛋白質的量。存在于蒸餾液中的誘發微藻細胞自解的活性物質對于 小球藻、微星藻以及擬球藻的破胞功效分別結果如圖3A、3B與3C所示。
[0110] 根據圖3A、3B與3C可知，存在于蒸餾液中的誘發微藻細胞自解的活性物質對于小 球藻、微星藻以及擬球藻皆具有破胞效果。
[0111] 實施例4、誘發微藻細胞自解的活性物質在冷凍后與冷凍后加熱的功效評估
[0112] 1.誘發微藻細胞自解的活性物質的制備
[0113] (1)蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
[0114] 將蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示的培養液與培養條件進行培養
[0115] 培養液：2g/L蛋白胨+0. 2g/L酵母菌提取物
[0116] 培養條件：在150rpm的震蕩速率下，以28°C培養2天
[0117] (2)誘發微藻細胞自解的活性物質的分離純化
[0118] 于蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成后，取300mL的培養液通過減壓蒸餾程序進 行分離純化，并獲得l〇〇mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾的條件如下所示：
[0119] 蒸餾溫度：50°C
[0120] 壓力：110hPa
[0121] 時間：2小時。
[0122] (3)誘發微藻細胞自解的活性物質的冷凍與冷凍后加熱
[0123] 將上述蒸餾液（活性物質溶液）置于-20°C以不同時間長度進行冷凍，且之后將其 取出于室溫解凍。
[0124] 將冷凍達72小時的蒸餾液（活性物質溶液），解凍后置于60°C、70°C或80°C高溫 水浴8小時。
[0125] (4)小球藻的破胞
[0126] 將新鮮的小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻懸浮液。接著將上方所得的經 冷凍的蒸餾液或經冷凍后加熱的蒸餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻于懸浮液的濃度 為約l〇g/L。
[0127] 然后，于不同時間點取出部分懸浮液以測定懸浮液的280nm吸光值，以評估小球 藻因細胞壁破壞而釋出的蛋白質的量。經冷凍的蒸餾液或經冷凍后加熱的蒸餾液的破胞功 效分別如圖4A與4B所不。
[0128] 根據圖4A與4B可知，隨冷凍時間增加，蒸餾液破胞活性逐漸減少，至冷凍達72小 時，蒸餾液幾乎不具破胞活性。相對地，當將經冷凍的蒸餾液再進行加熱，則蒸餾液的活性 可恢復至約70% (相較于未經冷凍的蒸餾液的破胞活性（未顯示））。
[0129] 故，根據上述可知，冷凍會使存在于蒸餾液中的誘發微藻細胞自解的活性物質失 活，而相對地，加熱可恢復存在于蒸餾液中的誘發微藻細胞自解的活性物質的活性。
[0130] 實施例5、通過活性物質所誘發的微藻破胞的微藻內油脂萃取與回收的活性物質 的功效測試
[0131] 1.誘發微藻細胞自解的活性物質的制備
[0132] (1)蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
[0133] 將蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示的培養液與培養條件進行培養
[0134] 培養液：2g/L蛋白胨+0. 2g/L酵母菌提取物
[0135] 培養條件：在150rpm的震蕩速率下，以28°C培養2天
[0136] (2)誘發微藻細胞自解的活性物質的分離純化
[0137] 于蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成后，取300mL的培養液通過減壓蒸餾程序進 行分離純化，并獲得l〇〇mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾的條件如下所示：.
[0138] 蒸餾溫度：50°C
[0139] 壓力：110hPa
[0140] 時間：2小時。
[0141] 2.小球藻的破胞
[0142] 將新鮮的小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻懸浮液。接著將上方所得的蒸 餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻于懸浮液的濃度為約l〇g/L。之后將懸浮液靜置24 小時。
[0143] 3.小球藻內的油脂萃取
[0144] 于懸浮液靜置24小時后，將懸浮液離心，獲得小球藻的藻體。之后對小球藻進行 油脂萃取，并進行脂肪酸甲酯（fatty acid methyl ester, FAME)分析，以測定油脂含量。
[0145] 4.活性物質的回收
[0146] 于懸浮液靜置24小時后，將懸浮液離心，取得上清液。然后將300mL的上清液通 過減壓蒸餾程序進行分離純化，并獲得l〇〇mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾的條件如下所示：
[0147] 蒸餾溫度：50°C
[0148] 壓力：110hPa
[0149] 時間：2小時。
[0150] 5.回收的活性物質的功效測試
[0151] 依照前述微藻破破胞方法以回收步驟中所獲得的蒸餾溶液進行微藻破胞，且于微 藻破胞后以前述相同方式分析微藻油脂含量并再次回收活性物質。將活性物質重復回收與 使用，并測定微藻破胞后的油脂含量達四次。結果如圖5所示。
[0152] 根據圖5可知，活性物質具有誘發微藻破胞并促進油脂萃取的功效，且，活性物質 使用后可被回收并繼續用于使微藻破胞，但其活性會略有下降。
[0153] 實施例6、攪拌對于活性物質誘發微藻破胞的影響
[0154] 1.誘發微藻細胞自解的活性物質的制備
[0155] (1)蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
[0156] 將蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示的培養液與培養條件進行培養
[0157] 培養液：2g/L蛋白胨+0. 2g/L酵母菌提取物
[0158] 培養條件：在150rpm的震蕩速率下，以28°C培養2天
[0159] (2)誘發微藻細胞自解的活性物質的分離純化
[0160] 于蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成后，取300mL的培養液通過減壓蒸餾程序進 行分離純化，并獲得l〇〇mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾的條件如下所示：.
[0161] 蒸餾溫度：50°C
[0162] 壓力：110hPa
[0163] 時間：2小時。
[0164] 2.小球藻的破胞
[0165] 將新鮮的小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻懸浮液。接著將上方所得的蒸 餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻于懸浮液的濃度為約10 g / L。之后，將懸浮液靜置 (不攪拌），或將懸浮液以lOOrpm進行水平震蕩。
[0166] 然后，于不同時間點取出部分懸浮液以測定懸浮液的280nm吸光值，以評估小球 藻因細胞壁破壞而釋出的蛋白質的量。結果如圖6所示。
[0167] 根據圖6可明確得知，無攪拌條件下可在12-16小時完成破胞。又，相較于攪拌處 理，無攪拌條件下活性物質的微藻破胞效率較佳，不論是起始的破胞速率或最后的破胞率， 無攪拌條件下活性物質的微藻破胞效率都較lOOrpm攪拌條件下高出近100%。
[0168] 實施例7、不同的細菌培養時間所獲得的培養液的蒸餾液的微藻破胞效功效測試
[0169] 1.誘發微藻細胞自解的活性物質的制備
[0170] (1)不同培養時間的蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
[0171] 將蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示的培養液與培養條件進行培養
[0172] 培養液：2g/L蛋白胨+0. 2g/L酵母菌提取物
[0173] 培養條件：
[0174] (i)在150rpm的震蕩速率下，以28°C培養1天；
[0175] (ii)在150rpm的震蕩速率下，以28°C培養2天
[0176] (2)減壓蒸餾
[0177] 于蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成后，取300mL的培養液通過減壓蒸餾程序進 行分離純化，并獲得l〇〇mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾的條件如下所示：
[0178] 蒸餾溫度：50°C
[0179] 壓力：110hPa
[0180] 時間：2小時。
[0181] 2.小球藻的破胞
[0182] 將新鮮的小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻懸浮液。接著將上方所得的蒸 餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻于懸浮液的濃度為約l〇g/L。之后將懸浮液靜置24 小時。
[0183] 3.小球藻內的油脂萃取
[0184] 于懸浮液靜置24小時后，將懸浮液離心，獲得小球藻的藻體。之后對小球藻進行 油脂萃取，并進行脂肪酸甲酯（fatty acid methyl ester, FAME)分析，以測定油脂含量以 此評估小球藻破胞情況。不同的細菌培養時間所獲得的活性物質的微藻破胞效果，如圖7 所示。
[0185] 圖7顯示，來自通過培養蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1菌株1天至對數生長期末期所 獲得的培養液的蒸餾液，并無明顯破胞能力，而來自通過培養蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1菌 株2天所獲得的培養液的蒸餾液則具有明顯的破胞能力。
[0186] 因此，由上述可知，蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1菌株應于生長穩定期之后才會開始 分泌誘發微藻細胞自解的活性物質。
[0187] 實施例8、以不同方式破胞的微藻的含水率
[0188] 將未經破胞的小球藻懸浮液、經實施例1的方法破胞的小球藻懸浮液，以及經機 械破胞（球磨15分鐘破胞）的小球藻懸浮液，分別以500rpm離心15分鐘，之后取濃縮藻 泥測試其含水率。結果如表1所示。
[0189] 表1、以不同方式破胞的微藻的含水率
[0190]
[0191] 表1顯示，以實施例1的方法破胞的微藻的含水率與未破胞的微藻的含水率相近， 而經機械破胞的微藻的含水率較高。
[0192] 而破胞后的微藻含水率越低，代表所使用的破胞方法使破胞后的微藻具有較佳的 脫水性。微藻的脫水性佳，則代表容易回收破胞的微藻所釋放出的物質與用以破胞的活性 物質。
[0193] 因此，根據表1所示的結果可知，相較于機械破胞，以實施例2的方法破胞，可使破 胞的微藻具有較佳的脫水性，且較易回收微藻所釋放出的物質與用以破胞的活性物質。
[0194] 實施例9、適用于獲得誘發微藻細胞自解的活性物質的減壓蒸餾的溫度及壓力范 圍測定
[0195] 1.誘發微藻細胞自解的活性物質的制備
[0196] (1)蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
[0197] 將蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示的培養液與培養條件進行培養
[0198] 培養液：2g/L蛋白胨+0. 2g/L酵母菌提取物
[0199] 培養條件：在150rpm的震蕩速率下，以28°C培養2天
[0200] (2)誘發微藻細胞自解的活性物質的分離純化
[0201] 于蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成后，將培養液在不同溫度下，以不同的壓力 分別進行減壓蒸餾，并測得各溫度的水沸騰壓力。
[0202] 2.微藻的破胞與活性物質揮發界線壓力評估
[0203] 將新鮮的小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻懸浮液。接著分別將上方所述 以不同溫度不同壓力的減壓蒸餾所獲得的不同蒸餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻于 懸浮液的濃度為約l〇g/L。然后將懸浮液靜置8小時。
[0204] 然后，測定以各不同蒸餾液處理的懸浮液的280nm吸光值，以評估小球藻的細胞 壁是否被破壞，并進而得知活性物質在各溫度下的最大揮發壓力（蒸餾壓力界線）。結果如 表2與圖8所示。
[0205] 表 2
[0206]
[0207] 根據圖8可知，適用于獲得誘發微藻細胞自解的活性物質的減壓蒸餾的溫度及壓 力范圍由在活性物質最大發揮壓力與水沸騰壓力之間的灰色區域所表示。
[0208] 實施例10、活性物質溶液的高效液相色譜（HPLC)
[0209] (1)高效液相色譜
[0210] 將實施例1的方法中所獲得的蒸餾液進行高效液相色譜，而高效液相色譜的條件 如下所示：
[0211] 高效液相色譜的條件
[0212] (a)柱：Jupiter'。5m C4 柱（lOOx 4. 6mm)，Phenomenex ;
[0213] (b)檢測波長：214nm ;
[0214] (c)溶劑
[0215] 溶劑 A:0.1%TFA
[0216] 溶劑 B: 0· 1 % TFA+10 % CH3CN
[0217] 溶劑 C: 0· 1 % TFA+90 % CH3CN
[0218] (d)流速：lml/ 分鐘
[0219] (e)高效液相色譜梯度程序：如下方表3所示。
[0220] 表3、高效液相色譜梯度程序
[0221]
[0222] 之后，收集由高效液相色譜所獲得的各區段（不同時間點）的產物。又，活性物質 溶液的高效液相色譜的結果如圖9所示。
[0223] (2)確認活性物質所存在的活性溶液高效液相色譜的產物區段
[0224] 上方所述各區段的產物添加至小球藻懸浮液中（添加濃度約10wt% )并靜置8小 時。
[0225] 然后，測定以各區段的產物處理的懸浮液的280nm吸光值，以觀察小球藻的細胞 壁是否被破壞并確認活性物質所謂于的區段。結果顯示，活性物質分布在11. 5-13分鐘之 間的區段產物中（圖9中的黑色方框區域）。
[0226] 實施例11、活性物質的氣相色譜質譜分析（GC-MS)
[0227] 將通過高效液相色譜所獲得的具有破胞活性的在11. 5-13分鐘之 間的區段產物（圖9中的黑色方框區域）以60 °C加熱，并進行固相微萃取 (solid phase microextractior^SPMEMDVB/CAR/FOMS 纖維（fibers)為獲自 Supelco (Bellefonte，PA, USA))。
[0228] 之后，固相微萃取的產物進行氣相色譜質譜分析。氣相色譜質譜分析的條件如下 所示：
[0229] 氣相色譜質譜分析的條件：
[0230] Agilent 6890 氣相色譜儀
[0231] 極性鍵合相（polar bonded phase)BPX-5 融合（fused)娃毛細管（silica capillary column)，長 25m，內徑 0· 22mm，薄膜厚度 0· 25 μ m(SGE, Melbourne, Australia)。
[0232] 電子撞擊界面化（El interfaced)至Agilent 5973四極柱式質譜儀（quadrupole mass spectrometer)〇
[0233] NIST 11 質譜數據庫（spectra library)
[0234] 將柱的溫度程序化為以15 °C /分鐘，從50 °C (維持1分鐘）至250 °C (維持5分 鐘）。
[0235] 將氦氣以0. 6ml/分鐘的固定流速使用為載體氣體。
[0236] 不分流進樣器（splitless injector)的溫度為 270°C。
[0237] 傳輸管線（transfer line)的溫度為 250°C 〇
[0238] 離子源（ion source)與四極柱（quadrupole)的溫度維持于230°C與150°C。
[0239] 離子化（ionization)以70eV的撞擊電子（impacting electron)的動能來發生。 通過在m/z在10-600的質量范圍進行自動掃描（automatic scanning)以獲得質譜圖（Mass spectra)〇
[0240] 將前方所述由高效液相色譜所獲得的具有破胞活性的的區段產物，進行氣相色譜 質譜分析，并于第5. 9分鐘與8. 5分鐘各獲得一個可能與破胞活性有關的物質。接著，將前 述分別于第5. 9分鐘與8. 5分鐘所獲得的可能與破胞活性有關的物質進行質譜分析，其質 譜分析結果分別如圖10A與圖10B所示。
【主權項】
1. 一種誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，包括： 在培養液中接種一芽胞桿菌屬的菌株以獲得菌體懸浮液； 將在該菌體懸浮液中的芽胞桿菌屬的菌株培養至少至生長穩定期，至該芽胞桿菌屬的 菌株于該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清的狀態；以及 在該芽胞桿菌屬的菌株于該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清之后，將 該菌體懸浮液進行減壓蒸餾程序，以獲得活性溶液，其中該活性溶液中含有誘發微藻細胞 自解的活性物質。2. 根據權利要求1所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，其中該芽胞桿菌 屬的菌株包括蘇云金芽胞桿菌。3. 根據權利要求2所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，其中該蘇云金 芽胞桿菌包括蘇云金芽胞桿菌BCRC 14683或保藏編號為DSM29807的蘇云金芽胞桿菌 ITRI-Gl〇4. 根據權利要求1所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，其中該培養液的 成分包括蛋白胨與酵母菌提取物。5. 根據權利要求1所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，其中培養在該菌 體懸浮液中的該菌該芽胞桿菌屬的菌株約2-3天以至少至生長穩定期。6. 根據權利要求1所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，其中培養該芽胞 桿菌屬的菌株的溫度為約20-40°C。7. 根據權利要求1所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，其中培養該芽胞 桿菌屬的菌株的溫度為約28°C。8. 根據權利要求1所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，其中該減壓蒸餾 程序的蒸餾溫度為約40-90°C。9. 根據權利要求1所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，其中該減壓蒸餾 程序的蒸餾溫度為約50 °C。10. 根據權利要求1所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，其中該減壓蒸 餾程序的壓力為約65-550hPa。11. 根據權利要求1所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，其中該減壓蒸 餾程序的壓力為約llOhPa。12. 根據權利要求1所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，其中該減壓蒸 餾程序的蒸餾溫度為約50°C，而該減壓蒸餾程序的壓力為約llOhPa。13. 根據權利要求1所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，進一步包括，將 該活性溶液以高效液相色譜分離出該誘發微藻細胞自解的活性物質。14. 根據權利要求1所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，進一步包括，將 該活性溶液加熱，以避免其中的誘發微藻細胞自解的活性物質聚集而降低活性。15. 根據權利要求14所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，該活性溶液加 熱的溫度為約50-90 °C。16. 根據權利要求14所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，該活性溶液加 熱的溫度為約60、70或80 °C。17. 根據權利要求14所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，該活性溶液加 熱的時間為約2-10小時。18. 根據權利要求14所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，該活性溶液加 熱的時間為約8小時。19. 一種誘發微藻細胞自解的活性物質，由包括下列步驟的一方法所獲得： 在培養液中接種一芽胞桿菌屬的菌株接種以獲得菌體懸浮液； 將在該菌體懸浮液中的芽胞桿菌屬的菌株培養至少至生長穩定期，至該芽胞桿菌屬的 菌株于該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清的狀態；以及 在該芽胞桿菌屬的菌株于該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清之后，將 該菌體懸浮液進行減壓蒸餾程序，以獲得活性溶液，其中該活性溶液中含有誘發微藻細胞 自解的活性物質。20. 根據權利要求19所述的誘發微藻細胞自解的活性物質，其中該芽胞桿菌屬的菌株 包括蘇云金芽胞桿菌。21. 根據權利要求20所述的誘發微藻細胞自解的活性物質，其中該蘇云金芽胞桿菌包 括蘇云金芽胞桿菌BCRC 14683或保藏編號為DSM 29807的蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1。22. 根據權利要求19所述的誘發微藻細胞自解的活性物質，其中該培養液的成分包括 蛋白胨與酵母菌提取物。23. 根據權利要求19所述的誘發微藻細胞自解的活性物質，其中培養在該菌體懸浮液 中的該菌該芽胞桿菌屬的菌株約2-3天以達生長穩定期之后。24. 根據權利要求19所述的誘發微藻細胞自解的活性物質，其中培養該芽胞桿菌屬的 菌株的溫度為約20-40 °C。25. 根據權利要求19所述的誘發微藻細胞自解的活性物質，其中該減壓蒸餾程序的蒸 餾溫度為約40-90 °C。26. 根據權利要求19所述的誘發微藻細胞自解的活性物質，其中該減壓蒸餾程序的壓 力為約 65_55〇hPa。27. 根據權利要求19所述的誘發微藻細胞自解的活性物質，其中該減壓蒸餾程序的蒸 餾溫度為約50°C，而該減壓蒸餾程序的壓力為約llOhPa。28. 根據權利要求19所述的誘發微藻細胞自解的活性物質，其中該方法進一步包括， 將該活性溶液以高效液相色譜分離出該誘發微藻細胞自解的活性物質。29. 根據權利要求19所述的誘發微藻細胞自解的活性物質，其中該方法進一步包括， 將該活性溶液加熱，以避免其中的該誘發微藻細胞自解的活性物質聚集而降低活性。30. 根據權利要求29所述的誘發微藻細胞自解的活性物質，該活性溶液加熱的溫度為 約50-90°C，而加熱的時間為約2-10小時。31. -種誘發微藻細胞自解的方法，包括： 將微藻細胞與根據權利要求19所述的誘發微藻細胞自解的活性物質接觸，以誘發微 藻細胞自解。32. 根據權利要求31所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中將微藻細胞與根據權利要 求19所述的誘發微藻細胞自解的活性物質接觸的步驟包括： 將該微藻細胞與含該誘發微藻細胞自解的活性物質的該活性溶液混合以形成一混合 液；以及 將該混合液靜置或將該混合液持續攪拌后靜置，以使該微藻細胞自解并沉降。33. 根據權利要求32所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中該微藻細胞占該混合液的 約 4_50wt %。34. 根據權利要求31所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中將微藻細胞與根據權利要 求19所述的誘發微藻細胞自解的活性物質接觸的步驟包括： 將該微藻細胞與含該誘發微藻細胞自解的活性物質的活性溶液混合以形成一混合液； 以及 將該混合液靜置，以使該微藻細胞自解并沉降。35. 根據權利要求34所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中將該混合液靜置約5-30小 時。36. 根據權利要求34所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中將該混合液靜置于室溫。37. 根據權利要求31所述的誘發微藻細胞自解的方法，進一步包括，在將微藻細胞與 根據權利要求19所述的誘發微藻細胞自解的活性物質接觸之前，先將含該誘發微藻細胞 自解的活性物質的該活性溶液混合進行加熱，以避免其中的該誘發微藻細胞自解的活性物 質聚集而降低活性。38. 根據權利要求37所述的誘發微藻細胞自解的方法，將含該誘發微藻細胞自解的活 性物質的該活性溶液加熱的溫度為約50-90°C，而加熱的時間為約2-10小時。39. 根據權利要求33所述的誘發微藻細胞自解的方法，進一步包括，在該微藻細胞沉 降之后，回收該混合液的上清液，以回收于該上清液中的該誘發微藻細胞自解的活性物質。40. 根據權利要求39所述的誘發微藻細胞自解的方法，進一步包括，將該上清液進行 加熱，以避免其中的誘發微藻細胞自解的活性物質聚集而降低活性。41. 根據權利要求40所述的誘發微藻細胞自解的活性物質的制造方法，該上清液加熱 的溫度為約50-90°C，而加熱的時間為約2-10小時。42. 根據權利要求31所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中微藻細胞為一單細胞藻類 微生物，具有細胞壁外殼保護。43. 根據權利要求31所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中該微藻細胞為新鮮存活狀 態的微藻細胞。44. 根據權利要求31所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中該微藻細胞包括小球藻 (Chlorella sp·)、擬球藻（Nannochloropsis sp·)、扁藻（Tetraselmis sp·)、等鞭金藻 (Isochrysis galbana)或杜氏藻（Dunaliella sp. ) 〇45. -種誘發微藻細胞自解的方法，包括： 在培養液中接種一芽胞桿菌屬的菌株接種以獲得菌體懸浮液； 將在該菌體懸浮液中的菌該芽胞桿菌屬的菌株培養至少至生長穩定期之后； 在該芽胞桿菌屬的菌株于該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清之后，將 該菌體懸浮液取出； 將取出的菌體懸浮液進行減壓蒸餾程序，以獲得活性溶液，其中該活性溶液中含有誘 發微藻細胞自解的活性物質； 將該微藻細胞與含該活性溶液混合以形成一混合液；以及 將該混合液靜置，以使該微藻細胞自解并沉降。46. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中該芽胞桿菌屬的菌株包括 蘇云金芽胞桿菌。47. 根據權利要求46所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中該蘇云金芽胞桿菌包括蘇 云金芽胞桿菌BCRC 14683或保藏編號為DSM 29807的蘇云金芽胞桿菌ITRI-G1。48. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中該培養液的成分包括蛋白 胨與酵母菌提取物。49. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中培養在該菌體懸浮液中的 該菌該芽胞桿菌屬的菌株約2-3天以達該生長穩定期之后。50. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中培養該芽胞桿菌屬的菌株 的溫度為約20-40 °C。51. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中該減壓蒸餾程序的蒸餾溫 度為約40-90 °C。52. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中該減壓蒸餾程序的壓力為 約 65-550hPa。53. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中該微藻細胞占該混合液的 約 4_50wt %。54. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中將該混合液靜置約5-30小 時。55. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中其中將該混合液靜置于室 溫。56. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，進一步包括，在將該微藻細胞 與該活性溶液混合之前，先將該活性溶液混合進行加熱，以避免其中的該誘發微藻細胞自 解的活性物質聚集而降低活性。57. 根據權利要求56所述的誘發微藻細胞自解的方法，該活性溶液加熱的溫度為約 50-90°C，加熱的時間為約2-10小時。58. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，進一步包括，在該微藻細胞沉 降之后，回收該混合液的上清液，以回收于該上清液中的該誘發微藻細胞自解的活性物質。59. 根據權利要求58所述的誘發微藻細胞自解的方法，進一步包括，將該上清液進行 加熱，以避免其中的誘發微藻細胞自解的活性物質聚集而降低活性。60. 根據權利要求59所述的誘發微藻細胞自解的方法，該上清液加熱的溫度為約 50-90°C，加熱的時間為約2-10小時。61. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中微藻細胞為一單細胞藻類 微生物，具有細胞壁外殼保護。62. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中該微藻細胞為新鮮存活狀 態的微藻細胞。63. 根據權利要求45所述的誘發微藻細胞自解的方法，其中該微藻細胞包括小球藻、 擬球藻、扁藻、等鞭金藻或杜氏藻。
【文檔編號】C12R1/89GK105985986SQ201510085027
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月17日
【發明人】白明德, 韓忠正, 盧文章, 萬皓鵬, 張嘉修, 陳俊延, 張馨月
【申請人】財團法人工業技術研究院