一株嗜松籃狀菌菌株Li?93及其應用
【專利摘要】本發明提供了一株嗜松籃狀菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li?93，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.11765。本發明還提供一種用于制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的制品，該制品的活性成分為嗜松籃狀菌Li?93。本發明還提供一種制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法。利用上述制品和方法制備GAMG時，具有產物單一，無副產物生成的特點，在常規條件下制備GAMG得率為96％左右，高于現有水平，因此本發明為制備GAMG提供了一種簡單有效的產品及方法。CGMCC No.1176520151130
【專利說明】
-株嗜松籃狀菌菌株Li -93及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體設及一株產0-葡萄糖醒酸巧酶的嗜松籃狀菌菌株 及其應用。
【背景技術】
[0002] 甘草酸（Gly巧rrhizin，化）是甘草（Gly巧rrhiza uralensis)的主要有效成分之 一，是一種=祗皂巧類化合物，可作為天然的甜味劑，具有消炎、抗癌，抗腫瘤、保肝護肝及 增強細胞免疫調節的功效，此外還具有良好的美白作用，結合其消炎的功能，能起到潤膚和 清除自由基等多種功效，因此也被廣泛應用于化妝品領域。但是由于甘草酸極性較強，不易 透過細胞膜進入細胞內發揮藥理作用，不僅限制其功能的發揮，也造成藥物的浪費。單葡萄 糖醒酸基甘草次酸(Gly巧；rrhetinic acid monoglucuronide，GAMG)是甘草酸最外側糖巧 鍵裂解后，水解去除一分子葡萄糖醒酸后生成的產物，在保留甘草酸功效的同時因其具有 極性適中，易于透過細胞膜，生物利用度高，且具有更高的甜度，更好的生物安全性等優點 被認為是甘草酸良好的替代品。
[0003] 全細胞催化是指利用完整的生物機體作為催化劑進行底物催化與轉化，其本質是 利用細胞中的酶進行催化，但是相比于酶催化法，免去了酶的提取與純化過程，制備更簡 單，生產成本更低。本領域生產GAMG的方法有很多種，其中利用微生物細胞催化底物轉化是 一種有效的手段。發明專利申請20 141 0088328 . 3利用分離到的一株產紫青霉 Penicilliumpu巧urogenum Li-3,經固定化細胞處理后可連續轉化生產GAMG，采用不同處 理條件，制備GAMG的得率分別為8.5 %、16.9 %和34%。但是，如此低的得率對后續提取和純 化GAMG產生負擔，而且造成底物的浪費，難W滿足低成本，規模化的生產要求。因此，本領域 亟需篩選一種用于制備GAMG且產率高的新菌株。
【發明內容】
[0004] 本發明基于本領域上述不足和需求，提供一株分離所得的嗜松籃狀菌菌株 (Tala;romycespinophilun〇Li-93,該菌株可用于制備 GAMG，且 GAMG 產率較高。
[0005] 本發明的技術方案如下：
[0006] 一株嗜松籃狀菌（Talaromyces pinophilum)菌株Li-93,其保藏編號為：CGMCC No.11765。
[0007] 用于制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸的制品，其特征在于，所述制品的活性成分包 括所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93。
[000引用于制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸的制品，其特征在于，所述制品的活性成分是 所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93。
[0009] 所述制品還包括用于制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸的常規成分和/或用于培養所 述的嗜松籃狀菌菌株Li-93的培養基成分。
[0010] -種制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸的制品的制備方法，其特征在于，采用所述的 嗜松籃狀菌菌株Li-93作為制備所述制品的活性成分或活性成分之一;和/或
[0011] 在標有制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸用途的包裝盒內放置有所述的嗜松籃狀菌 菌株Li-93。
[0012] -種制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸的方法，其特征在于，在制備單葡萄糖醒酸基 甘草次酸的過程中添加和/或使用所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93。
[0013] 用于制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸的菌劑，其特征在于，所述菌劑的活性成分包 括所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93。
[0014] 用于制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸的菌劑，其特征在于，所述菌劑的活性成分是 所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93。
[0015] 所述菌劑，還包括用于制備菌劑的常規成分。
[0016] 所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93在制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸方面的應用。
[0017] 本發明從新疆甘草種植地±壤中分離到一株絲狀真菌，經ITS測序、序列比對、菌 落及菌體形態學鑒定，確定該菌株為一株嗜松籃狀菌(Talaromyces pino地ilus)，其被命 名為嗜松籃狀菌Li-93。
[0018] 本發明對上述嗜松籃狀菌Li-93在制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸(GAMG)的效果方 面進行了驗證，發現:該菌可定向將甘草酸或其鹽轉化生成GAMG，而無副產物GA的生成，在 常規條件下制備GAMG得率為96 %左右，高于現有技術水平。
[0019]由此可見，本發明提供的嗜松籃狀菌(Talaromyces pinophilus)菌株Li-93能較 為高效地制備GAMG,且該菌生長條件要求不高、獲取容易、成本低廉，為本領域制備GAMG提 供了一種簡單有效的產品和方法。
[0020] 所述嗜松籃狀菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li-93已送保藏，其保藏信息如 下：
[0021] 菌種保藏名稱:Li-93
[0022] 保藏號:CGMCC No. 11765
[0023] 分類命名:嗜松籃狀菌
[0024] 拉下名：Talaromyces pino地il皿
[0025] 保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、
[0026] 保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號
[0027] 保藏日期:2015年11月30日
【附圖說明】
[002引圖1是嗜松籃狀菌(Talaromyces pino地il皿化i-93光學顯微鏡圖；
[0029] 圖2是嗜松籃狀菌轉化甘草酸單錠鹽生成單葡萄糖醒酸基干草次酸(GAMG)的高效 液相色譜分析圖，1:甘草次酸(GA)的標準品；2 :GAMG的標準品；3:轉化前;4轉化后。
【具體實施方式】：
[0030] 下面結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，W下實施例僅用于說明本 發明而非用于限制本發明的范圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常 規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0031] 實施例1中用到的新疆甘草種植地±壤采集自中國新疆塔城額敏縣甘草種植地。
[0032] 實施例中用到的甘草酸單錠鹽的純度為75%，均購自新疆天山制藥廠。
[0033] W下實施例中用到的培養基分述如下：
[0034] 篩選平板：甘草酸單錠鹽3g/L，NaN〇3 3g/L，K2HP〇4 lg/L，KCl lg/L，MgS〇4 ? 7此0 0.5g/L，化2S04?7出0 0.01g/L，pH5.0，瓊脂30g/L。
[0035] 查氏酵母膏瓊脂培養基（CYA):化N03 3g/L，K2HP〇4 lg/L，MgS〇4 ? 7出0 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeS04 ? 7出0 O.Olg/L，薦糖20g/L，酵母粉提取物5g/L，瓊脂20g/L，自然pH。
[0036] 麥芽汁瓊脂培養基(MEA):麥芽提取物20g/L，葡萄糖20g/L，多聚蛋白腺Ig/L，瓊脂 20g/L，自然抑。
[0037] 燕麥瓊脂培養基(0A)制備方法如下：
[003引取30g燕麥加水至1000血，煮沸1小時后紗布過濾，取濾液加水補足至lOOOmL，加入 20g瓊脂，121°C高溫滅菌20min。
[0039] 馬鈴馨葡萄糖液(固）體培養基制備方法如下：
[0040] 稱取去皮馬鈴馨200g，加水800mL，煮沸30分鐘左右，紗布過濾，向濾液中加入20g 葡萄糖、溶解后補足水至lOOOmL，若是需要制成固體培養基，則向其中再添加20g瓊脂，自然 抑，121°C高溫滅菌15min。
[0041 ]二級種子培養基：去皮馬鈴馨200g，加水800mL，煮沸30分鐘左右，紗布過濾，取濾 液補足水至1000血后從中取出250血，加入8g葡萄糖，溶解后，加水至1000血，自然抑，121°C 高溫滅菌15min。
[0042] 發酵培養基的制備方法如下：
[0043] 取去皮馬鈴馨200g，加水800mL，煮沸30分鐘左右，紗布過濾，取濾液補足水至 lOOOmL后從中取出200mL，加水至lOOOmUpH 5.0，12rC高溫滅菌15min。
[0044] 本發明中GMG的產率定義為：
[0045]
[0046] 實施例1:嗜松籃狀菌Li-93的篩選與鑒定
[0047] 采集新疆甘草種植地±壤10旨，置于lOOmL無菌0.8%化C1溶液中，充分振蕩lOmin， 無菌濾紙過濾，取濾液分別稀釋1〇1、1〇2、1〇3、1〇4倍，將各個稀釋液涂布于篩選平板上，于28 °C培養。每24h觀察平板是否長出新的菌落，將新長的菌落進一步劃線分離W獲得純種菌 株。從中分離到一株絲狀真菌，命名Li-93。
[004引對該菌株Li-93的ITS序列進行測序，結果見SEQ ID No. 1所示。將序列進行BALST 比對，發現該菌與hlaromyces pinophilus NBRClOOSSSTjalaromyces pinophilus NRRL 58691 和hlaromyces pino地ilum NRRL 6420的TIS序列具有99%?上的同源性。
[0049] 將該菌抱子分別接于查氏酵母膏瓊脂培養基、麥芽汁瓊脂培養基、燕麥瓊脂培養 基，30°C培養5-7天，觀察該菌在各種培養基上生長形成的菌落形態。
[0050] 結果顯示:在查氏酵母膏瓊脂培養基上于28°C培養7天后，菌落直徑約為30mm，菌 絲呈絨狀、黃色，質地致密，菌落邊緣為白色，距離中屯、點約7mm處形成一圈凹槽，并W此圈 凹槽為起點，向外形成1-5條福射狀凹糟，背面為澄紅色。在麥芽汁瓊脂培養基上于28°C培 養7天后，菌落直徑約為40mm，菌絲呈厚絨狀、質地相對疏松、顏色從外向內依次為白色、黃 色和深綠色，中間形成約12mm直徑的圓形凸起，背面為澄紅色。在燕麥瓊脂培養基上于28°C 培養7天后，菌落直徑約為40mm，菌絲呈絮狀，質地疏松，邊緣為白色，中間為深綠色，背面無 色或局部呈淡澄色。
[0051] 顯微鏡下觀察:菌絲有隔膜，頂端生有掃靑狀的分生抱子頭，直立分生抱子梗上有 雙輪生小梗、對稱型，分生抱子呈串排列在小梗頂端、呈球形或近球形，如圖1所示。
[0052] 根據W上結果，鑒定篩選所得菌株為嗜松籃狀菌(Talaromyces pinophilus)，被 命名為Li-93。同時將該菌株Li-93送保藏，并作為本發明請求保護的菌株，其保藏號為 CGMCC No.11765。
[0053] 實施例2、采用本發明所述嗜松籃狀菌菌株Li-93制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸
[0054] 將嗜松籃狀菌Li-93接于斜面馬鈴馨葡萄糖固體培養基上，于3(TC培養3天。取斜 面上的抱子接種至馬鈴馨葡萄糖液體培養基上，于3(TC、200rpm的搖床上培養4她，然后W 體積比5%的接種量接于二級種子培養基中，30°C、200rpm的搖床上培養24h，得到二級種子 液。將二級種子液，W體積比10%的接種量接于發酵培養基中，30°C、200rpm搖床上培養12h 后，向其中加入甘草酸單錠鹽使其終濃度達到5g/L，于30°C、200rpm搖床上反應。每化取樣， 采用高效液相色譜檢測甘草酸單錠鹽的消耗量和GAMG的生成量，結果顯示2地后，甘草酸單 錠鹽轉化完畢，GAMG再無明顯增加，如圖2所示。經計算，GAMG的產率達到96.31 %。
[0055] 實施例3、本發明所述用于制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸的制品
[0056] 本實施例提供一種用于制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸的制品，該制品的活性成分 包括實施例1分離得到的嗜松籃狀菌菌株Li-93;和/或，
[0057] 該制品的活性成分是實施例1所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93。
[0058] 基于本實施例的所述用于制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸的制品，還包括用于制備 單葡萄糖醒酸基甘草次酸的常規成分和/或用于培養所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93的培養 基成分。
[0059] 本實施例還提供上述制品的制備方法，包括如下步驟:采用實施例1所述的嗜松籃 狀菌菌株Li-93作為制備所述制品的活性成分或活性成分之一;和/或
[0060] 在標有制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸用途的包裝盒內放置有實施例1所述的嗜松 籃狀菌菌株Li-93。
[0061 ]實施例4、本發明所述用于制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸的菌劑
[0062] 本實施例提供一種用于制備單葡萄糖醒酸基甘草次酸的菌劑，特征是，所述菌劑 的活性成分包括實施例1所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93;和/或
[0063] 所述菌劑的活性成分是實施例1所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93。
[0064] 所述菌劑還包括用于制備菌劑的常規成分。
【主權項】
1. 一株嗜松籃狀菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li_93,其保藏編號為:CGMCC No: 11765〇2. 用于制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品，其特征在于，所述制品的活性成分包括 權利要求1所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93。3. 用于制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品，其特征在于，所述制品的活性成分是權 利要求1所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93。4. 根據權利要求2或3所述的制品，其特征在于，所述制品還包括用于制備單葡萄糖醛 酸基甘草次酸的常規成分和/或用于培養所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93的培養基成分。5. -種制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品的制備方法，其特征在于，采用權利要求1 所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93作為制備所述制品的活性成分或活性成分之一;和/或， 在標有制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸用途的包裝盒內放置有權利要求1所述的嗜松籃 狀菌菌株Li-93。6. -種制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于，在制備單葡萄糖醛酸基甘 草次酸的過程中添加和/或使用權利要求1所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93。7. 用于制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的菌劑，其特征在于，所述菌劑的活性成分包括 權利要求1所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93。8. 用于制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸的菌劑，其特征在于，所述菌劑的活性成分是權 利要求1所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93。9. 根據權利要求7或8的菌劑，其特征在于，還包括用于制備菌劑的常規成分。10. 權利要求1所述的嗜松籃狀菌菌株Li-93在制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸方面的應 用。
【文檔編號】C12N1/14GK106047713SQ201610245351
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年4月19日
【發明人】李春, 徐贏華, 賈錦彤, 馮旭東, 呂波
【申請人】北京理工大學, 南京精微生物科技有限公司