重組菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及微生物領域，特別設及重組菌株及其應用。
【背景技術】
[0002] 谷氨酸(Glutamic acid),其學名為2-氨基-5-梭基戊酸，是構成蛋白質的20種常 見氨基酸之一。谷氨酸是目前世界上產量最大的氨基酸品種，全球每年對谷氨酸的需求量 達到2500萬噸。1^-谷氨酸是谷氨酸的左旋體，其具有增鮮、降低血氨、改善中樞神經系統、改 善兒童智力發育、擴張血管、增強血液循環、促進花穗發育等功能，并且可W生產許多重要 的下游產品，如k谷氨酸鋼、k蘇氨酸、聚谷氨酸等，被廣泛應用于食品、醫藥、人造制革、化 妝品、農業等行業。
[0003] 谷氨酸的制備起始于18世紀。1866年德國化學家從小麥面筋的水解物中提取得到 谷氨酸，1957年日本率先從自然界分離得到谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)，開啟了利用糖和氨發酵生產谷氨酸的研究，因發酵法具有原料成本低、反應 條件溫和、可大規模生產等優點，目前仍是谷氨酸生產的主要方法。
[0004] 谷氨酸棒桿菌是一種好氧、不產抱子的革蘭氏陽性細菌，基因組大小為3282化，它 不僅能利用葡萄糖為唯一碳源進行生長，而且能利用包括乙酸和噓拍酸在內的其它有機酸 和碳水化合物為唯一碳源或混合碳源進行生長。谷氨酸棒桿菌為生物素缺陷型，需要補充 生物素才能生長。當培養基中的生物素過量時，菌體不向細胞外分泌產生谷氨酸；當生物素 被限量添加時，菌體則大量分泌產生谷氨酸，因而野生型的谷氨酸棒桿菌可通過生物素限 量添加來誘導分泌產生谷氨酸。此外，在生物素過量的情況下通過添加某種表面活性劑如 Twee40或TweenSO也能誘導谷氨酸棒桿菌過量合成谷氨酸。
[0005] 近年來，隨著谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC13032基因組測序的完成W及谷氨酸棒 桿菌基因操作技術的不斷完善，使得通過分子生物學手段對谷氨酸棒桿菌進行相關改造成 為現實。谷氨酸在生物體內的合成代謝途徑也已相繼報道，見圖1。日本味之素株式會社依 據谷氨酸合成的代謝途徑對谷氨酸生產菌種作了一些基因改造，如引入棒狀細菌的巧樣酸 合成酶基因使腸細菌生產谷氨酸的能力增強;增加丙酬酸脫氨酶基因的拷貝數而增強丙酬 酸脫氨酶活性，并使棒狀細菌的谷氨酸生產能力提高;過表達YHFK基因使k谷氨酸產量提 局等。
[0006] 現有技術往往需要在培養基中添加過量的生物素及表面活性劑如Twee40或 TweenSO，增加了生產成本，且產率往往較低。
【發明內容】
[0007] 有鑒于此，本發明提供一種重組菌株及其應用。與野生菌株相比，本發明提供的菌 株顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)提高了谷氨酸的發酵產量。
[000引為了實現上述發明目的，本發明提供W下技術方案：
[0009]本發明提供了一種重組菌株，其包含編碼突變yg濁蛋白質的突變yg濁基因。
[0010] 在本發明的一些具體實施方案中，所述重組菌株中所述突變yggB蛋白質為A106氨 基酸處具有突變。
[0011] 在本發明的一些具體實施方案中，所述重組菌株中所述突變yggB蛋白質具有 A106V突變，獲得的菌株命名為MHZ-0112-1。
[0012] 在本發明的一些具體實施方案中，所述重組菌株還包括編碼降低ODHC活性的突變 O化A基因；所述突變O^A基因為對O^A基因進行失活改造。具體的，本發明提供的含有突變 O化A基因的菌株命名為MHZ-0112-2。制備方法如下：
[0013] 由谷氨酸合成代謝途徑（圖1)可知，S簇酸循環中由a-酬戊二酸脫氨酶復合體 (ODHC)催化的a-酬戊二酸向班巧酷輔酶A的轉化是谷氨酸合成代謝主要的競爭途徑，為了 降低0畑C的活性，需將其Elo亞基的編碼基因O^A進行失活改造。采用的手段是引入堿基缺 失，使蛋白合成過程中出現移碼突變，從而達到失活的目的。
[0014] 在NCBI GenBank數據庫中獲得谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutami州mATCC13869)o化A基因（Gene Bank N0.NCgll084)的核巧酸序列（SEQ ID No.9)， 由此核巧酸序列設計在特定位置引入堿基缺失W使OdM基因失活，基于堿基序列及所選缺 失位置合成了四條引物（如SEQ ID NO. 10-13所示）。利用化USion超保真聚合酶（New 化gland BioLabs)，WB1/B2，B3/B4作為引物，W谷氨酸棒桿菌ATCC 13869的基因組DNA作 為模板制備O^A堿基缺失位點的上下游片段。PCR程序為，98 °C變性IOs，50°C復性20s，72°C 延伸20s，循環30次后。所得兩個片段經瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根)純化后，利用引物組 B1/B4進行overlap PCR擴增得到產物，經瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根)純化后利用EcoRI/ BamHI進行消化，同時將pK18-mobsacB利用EcoRI/BamHI進行消化，并用T4DNA連接酶 (TransGen Biotech)將片段與載體進行連接，轉化Trans ITl感受態細胞（TransGen Biotech)，挑取卡那抗性克隆，EcoRI/BamHI酶切鑒定得到over lap PCR片段插入 pKlSmobsacB的陽性克隆，進一步通過測序（Invitrogen公司）鑒定插入的片段確實為〇化八 基因待缺失位點的上下游片段。
[0015] 將所得到的質粒命名為地18-0化Adal。將地18-0化Adal轉入M監-Ol 12-1菌株中。 在含有15mg/L的卡那霉素的選擇培養基上選擇單交換轉化體，其中帶有OdM堿基缺失的序 列通過與內源O^A基因同源重組連同重組載體整合到基因組中。利用化St化q DNA聚合酶 (TransGen Biotech), WB1/T2，T1/B4 引物對進行菌落 PCR 鑒定 Kan^ 克隆，PCR 參數為：94°C 3〇3,5〇1：3〇3,721：4〇3，共26個循環，兩個引物對均擴增出目的片段的克隆為陽性克隆。將 挑選出的陽性克隆接種入無抗冊I培養基中培養12~1地，將菌液稀釋100-1000倍后涂布在 含有10%薦糖的固體BHI培養基上培養36h，將所篩選出的菌株進一步進行卡那抗性表型驗 證，挑選KanS的重組子利用B1/B4引物對擴增目的片段，陽性克隆的目的片段較野生型所擴 增的片段小，將陽性克隆進行測序驗證，得到O^A堿基缺失的菌株，命名為MHZ-Ol 12-2。
[0016] 在本發明的一些具體實施方案中，所述重組菌株還包括突變gdh基因；所述突變 g化基因為過表達g化基因。
[0017] 在本發明的一些具體實施方案中，所述重組菌株還包括突變gltA基因；所述突變 gltA基因為過表達gltA基因。
[0018] 在本發明的一些具體實施方案中，所述重組菌株中所述過表達通過構建過表達載 體或者插入啟動子的方式增強所述基因的表達。
[0019] 在本發明的一些具體實施方案中，所述重組菌株中所述過表達載體為祀c-gdh或 pEC-gltA;所述啟動子為sod或Uif。
[0020] 分別根據NCBIGenBank數據庫中g化基因（Gene Bank N0:NCgll084)的序列（SEQ N0.14)和gltA基因（GeneBankN0:NCgl0795)的序列（SEQN0.15)設計引物，如SEQID NO. 16~19所示。
[0021 ]整合質粒地 18-Psodg 化，pKl8-1:ufgltA 的構建：
[0022] W谷氨酸棒桿菌ATCC13869基因組作為模板，分別WC1/C2，D1/D2引物對擴增g化 及gltA兩個基因的全長片段，經瓊脂糖凝膠電泳及膠回收純化后，將所得片段分別利用 EcoRI/Sall雙酶切，質粒祀C-XK9犯(61:29164935)也進行相同的雙酶切，利用140臟連接酶 進行連接，轉化化anslTl感受態細胞后篩選陽性克隆，提取質粒分別進行EcoRI/Sall雙酶 切鑒定，最后進行測序確認，所得質粒分別命名為祀C-g化，祀C-gltA。制備M監-Ol 12-2的感 受態細胞并將對照質粒祀(：-乂1(9犯及上述所構建96(：-肖化，96(：-肖114轉入順2-0112-2菌株 中。利用KanlSBHI平板篩選出陽性克隆，并提取質粒驗證，所得到的S個帶有復制性質粒的 菌株分別命名為MHZ-0112-3，MHZ-0112-4，MHZ-0112-5。
[0023] W谷氨酸棒桿菌ATCC13869的基因組為模板，分別WC3/C4，C5/C6，C7/C8引物對 (如SEQ ID NO. 20~31所示)在化USion超保真聚合酶的作用下PCR擴增，得到g化起始密碼 子的上游同源臂、SOd啟動子和起始密碼子的下游同源臂，PCR參數為98°C10s，50°C20s，72 °C20s，共30個循環。將PCR產物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行割膠回收。W上述所得片段混 合物為模板，WC3/C8引物對進行overlap PCR擴增，并割膠回收，產物用Sail和化ndIII雙 酶切，pKlSmobsacB用同樣的酶進行切割，利用T4DNA連接酶在22°C下連接1-化，轉化 化anslTl感受態細胞，挑取卡那抗性克隆，SalIMindHI酶切鑒定得到overlap PCR片段插 入地ISmobsacB的陽性克隆，進一步通過測序鑒定插入的片段確實為添加了Psod啟動子的 g化基因上下游同源臂。所得到的質粒命名為地18-Psodg化。
[0024] 地18-tufgltA的構建過程與上述類似，所用引物對為D3/D4，D7/D8擴增gltA起始 密碼子的上下游同源臂，WD5/D6擴增啟動子Ptuf ,Overlap PCR所用引物對為D3/D8。
[00巧]高表達菌株的制備：
[00%] 制備M監-0112-2菌株的感受態細胞，分別將質粒地18斗3〇(1旨化，91(18-1證旨11八進 行轉化。
[0027] 在含有15mg/L的卡那霉素的選擇培養基上選擇單交換轉化體，其中帶有sod(tuf) 啟動子的序列通過與內源gdh(gltA)基因同源重組連同重組載體整合到基因組中。利用 Fast hq DNA聚合酶，WC3/T2，T1/C6引物對（或D3/T2，T1/D6引物對)進行菌落PCR鑒定 KanK克隆，PCR參數同上，兩個引物對均擴增出目的片段的克隆為陽性克隆。將挑選出的陽 性克隆接種入無抗BHI培養基中培養12-1地，將菌液稀釋100-1000倍后涂布在含有10%薦 糖的固體BHI培養基上培養36h，將所篩選出的菌株進一步進行卡那抗性表型驗證，挑選 Kan%重組子利用C3/C6引物對(或D3/D6引物對)擴增目的片段，陽性克隆的目的片段比野 生型所擴增的片段大，將陽性克隆進行測序驗證，得到sod(tuf)啟動子成功整合至gdh (gltA)基因 ATG 之前的菌株，命名為 MHZ-0112-6(MHZ-0112-7)。
[0028] 同理，制備M監-0112-6感受態細胞，將地18-tufgltA進行轉化，經兩輪重組篩選， 得到gdh與gltA疊加的突變株MHZ-0112-8。