一種定量菌株的固態冷凍干燥物及制備方法和使用方法與流程

本發明涉及一種定量菌株的固態冷凍干燥物及制備方法和使用方法，適用但不局限于制備符合中國藥典中生物檢查法要求的檢驗菌種。

背景技術：

本發明接種在凍干物中的接種材料一般為單種或多種微生物，例如藥品、食品、化妝品、醫療器械等檢驗中使用到的某種菌株。所以本發明制備的凍干物可使用在多個領域中，特別是藥品、食品、化妝品等領域，適用但不局限于生物檢查法、靈敏度試驗、無菌檢查、抑菌效力檢查、定量定性對照、微生物檢驗質量控制等。

為了更好的闡述本發明，特別的以中國藥典中的生物檢查法作為典型，描述本發明。

中國藥典中指出：生物檢查法系用于檢查中國藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。無菌檢查所涉及的領域十分廣泛，且與人的身體健康、生命安全息息相關，是非常重要的環節。無菌檢查法中涉及到的多個菌株的標準菌液的制備，其要求是：所用的菌株傳代次數不超過5代；采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性；方法適用性試驗時所用菌液含菌量小于100cfu。

在傳統的菌液制備前，需要先購買標準菌株，該菌株的保存條件較高。然后接種各菌株至相應的固體或半固體培養基中，培養18h-48h，黑曲霉等更是需要培養5d-7d，最后稀釋至每毫升含菌量小于100cfu的菌懸液，該稀釋的精確度難以把控，缺點體現在以下兩方面：1.稀釋級別和最終吸取量都需要由稀釋人員根據經驗把控，但由于菌株退化或培養條件不同等原因，每次培養的菌苔活菌數偏差較大，難以做到準確；2.最終吸取的菌液含菌量需要等待計數結果出來才可以確定，而計數結果又需要數日才能確定，然而這樣做，如果含菌量超出標準范圍，但已經使用此稀釋液完成了相關實驗，實驗結果肯定不符合中國藥典要求且無法彌補。

如今各種生物制品層出不窮，保藏方法繁多，但效果最突出，使用最廣泛，最方便工業化的還是凍干。如今凍干技術發展迅速，能滿足大多凍干制品的生產。 凍干技術主要是在凍干保護劑的保護下，可將生物制品97％以上的水分除去，但盡量保持其生物活性，讓其處于一種休眠狀態。如果加適量恢復液，即可迅速溶解，并恢復其生物活性，用于后續實驗。

在現有技術中，如需獲得一定菌數含量的菌液，最主要的方法之一還是按照中國藥典所述依次稀釋，得到含菌量小于100cfu的菌液。這種方法既浪費資源又繁瑣。

技術實現要素：

本發明將標準菌株繁殖后，稀釋至確定量的菌數后，將其與保護劑融合，并凍干，凍干后同一規格含菌量一定。一方面可減少因稀釋導致的時間、材料和人力上的浪費，另一方面可提高最終一定體積凍干物中菌含量的精確度。

本發明公開了一種定量菌株固態、冷凍干燥物的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：制備GS(Gelatin Sucrose)保護劑。所述的保護劑包括4℃保存備用的A、B部分：

A部分：煮沸完全溶解于適量純化水的明膠，煮沸完全溶解于適量純化水的蔗糖，完全溶于適量純化水的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉、酵母粉、活性炭，將上述三者混合，調節pH值至7.2±0.2，121℃滅菌15min，4℃備用。

B部分：煮沸完全溶解于適量純化水的葡萄糖，116℃滅菌15min，4℃備用；

步驟2：制備溶解劑。將含量分別為氯化鈉0.8％-1％，磷酸氫二鉀0.5％-1％，胰蛋白胨0.5％-2％，酵母粉0.5％-2％的水溶液分裝后121℃滅菌15min，制備成溶解劑，4℃備用；

步驟3：制備微生物懸液。包括接種微生物到相應的培養基上培養，培養完成后用適量溶解劑洗脫菌苔或孢子，4500rpm，離心8min，棄上清，再用步驟2中適量溶解劑溶解，重復清洗兩次，最后用步驟2中溶解劑適量將菌泥溶解混勻,十倍梯度稀釋至所需的稀釋級；

步驟4：將步驟3中所需稀釋級的菌液取適當量進行凍前計數；

步驟5：制備凍干菌懸液。結合步驟4的計數結果，步驟3中通過凍干存活率計算所需稀釋級別，該稀釋級的菌液與GS保護劑以一定比例混合均勻制成凍干菌懸液，該菌懸液包括葡萄糖0.1％-0.5％、蔗糖5％-10％、明膠0.5％-1.5％、胰蛋白胨1％-2％、大豆蛋白胨0.5％-1％、氯化鈉0.5％-1％、酵母粉0.2％-0.5％和活性 炭0.2％-0.5％以及每50ul-100ul菌懸液凍干后存活菌數在100cfu-1000cfu的活菌；

步驟6：凍干成品。上述步驟5中凍干菌懸液進行制品凍干，凍干結束后，將制品在無菌環境下轉移至西林瓶中，每個西林瓶中含一個單位的圓柱形凍干制品，蓋上瓶塞，轉移回凍干機，在200mbar真空度下，25℃干燥1h，在該真空度下進行壓塞，然后放氣、出箱、壓鋁蓋。

作為進一步改進，上述的微生物包括接種于相應培養基上的細菌或/和真菌。上述的細菌包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌或/和生孢梭菌。上述的真菌包括黑曲霉或/和白色念珠菌。

作為進一步改進，上述的步驟4具體包括將步驟3中菌懸液在無菌環境下分裝至圓柱狀模具中，放入凍干機中，-40℃預凍2h，再以200mbar的真空度，-30℃干燥8h，升溫至25℃繼續干燥，以壓升測試180sec內壓升范圍小于50mbar為判斷點結束干燥過程，將干燥完成的制品進行凍后計數，計算得到凍干后的存活率。上述步驟6中，50ul-100ul的凍干菌懸液作為一個單位進行制品凍干。

本發明還公開了一種定量菌株的固態、冷凍干燥物，包括葡萄糖0.1％-0.5％、蔗糖5％-10％、明膠0.5％-1.5％、胰蛋白胨1％-2％、大豆蛋白胨0.5％-1％、氯化鈉0.5％-1％、酵母粉0.2％-0.5％和活性炭0.2％-0.5％配置成溶液構成的保護劑，所述的保護劑與菌液按所需比例均勻混合被凍干制成圓柱狀的干燥物，所述的圓柱狀凍干物中含有100cfu-1000cfu存活菌量。

作為進一步改進，所述的每個圓柱狀凍干物由50ul-100ul凍干菌懸液凍干而成。上述的圓柱狀凍干物中可定制特定范圍含菌數。

本發明還公開了一種固態、冷凍干燥物依照上述方法制成定量菌株固態、冷凍干燥物的使用方法，將凍干物倒入裝有N ml溶解劑的無菌容器中，溶解該制品，混合均勻，每次取N/10ml用于檢測，菌含量小于100cfu，所述的溶解劑包括4℃備用氯化鈉0.8％-1％，磷酸氫二鉀0.5％-1％，胰蛋白胨0.5％-2％，酵母粉0.5％-2％的水溶液分裝后121℃滅菌15min制備的溶解液，所述的N為1ml-10ml。

本發明與現有技術相比較，包括葡萄糖0.1％-0.5％、蔗糖5％-10％、明膠0.5％-1.5％、胰蛋白胨1％-2％、大豆蛋白胨0.5％-1％、氯化鈉0.5％-1％、酵母粉0.2％-0.5％和活性炭0.2％-0.5％配制成溶液作為保護劑，與稀釋后的菌懸液按一定 配比混合均勻之后利用凍干機將其制成圓柱狀的干燥制品，制品外觀光滑平整，溶解性佳，1-2秒內即可完全溶解于溶解劑中。其有益效果是，該圓柱狀凍干物中含有100cfu-1000cfu菌量或可定制特定范圍含菌數。取單個凍干物溶于N ml溶解液中，每N/10ml即含菌小于100cfu，精確方便。

保護劑的使用可以大大減小凍干過程中菌株受損程度，合適的保護劑將給制品提供一個良好的形狀和凍干環境，確保菌株的活性受到最大程度的保護。溶解劑將給菌株提供良好的pH值,滲透壓及適當營養物質，以保證菌株溶解后能得到最佳的復蘇條件。

本發明相比較傳統保護劑而言，有以下優點：

1.凍干存活率更高，達60％-90％；

2.外觀更光滑美觀，較易從模具上脫落；

3.凍干制品更加堅固，不易在運輸過程中碎裂；

4.溶解性更佳，可在1s-2s完全溶解；

5.配制快捷簡單，只需將各組分按照相應要求準確稱量溶解后高溫高壓滅菌，滅菌一步到位。無需對有生物活性的組分另行過濾除菌，有效減少了傳統保護劑繁雜的實驗步驟，進一步避免了感染菌的風險。

附圖說明

圖1是本發明制品在標準2ml西林瓶中的示意圖。

圖2是本發明固態、冷凍干燥物的制備流程框圖。

具體實施方式

參見圖1-2，本實施案例一種定量菌株的固態、冷凍干燥物，包括葡萄糖0.1％-0.5％、蔗糖5％-10％、明膠0.5％-1.5％、胰蛋白胨1％-2％、大豆蛋白胨0.5％-1％、氯化鈉0.5％-1％、酵母粉0.2％-0.5％和活性炭0.2％-0.5％配置成溶液構成的保護劑，所述的保護劑與菌液按所需比例均勻混合被凍干制成圓柱狀的干燥物，所述的圓柱狀凍干物中含有100cfu-1000cfu存活菌量。或可定制特定范圍含菌數。

每個圓柱狀凍干物由50ul-100ul凍干菌懸液凍干而成，當然圓柱狀凍干物中可根據需要定制特定凍干菌懸液的體積。

一種定量菌株固態、冷凍干燥物的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：制備GS(Gelatin Sucrose)保護劑。保護劑包括4℃保存備用的A、 B部分：

A部分：煮沸完全溶解于適量純化水的明膠，煮沸完全溶解于適量純化水的蔗糖，完全溶于適量純化水的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉、酵母粉、活性炭，將上述三者混合，調節pH值至7.2±0.2，121℃滅菌15min，4℃備用。

B部分：煮沸完全溶解于適量純化水的葡萄糖，116℃滅菌15min，4℃備用；

步驟2：制備溶解劑。將含量分別為氯化鈉0.8％-1％，磷酸氫二鉀0.5％-1％，胰蛋白胨0.5％-2％，酵母粉0.5％-2％的水溶液分裝后121℃滅菌15min，制備成溶解液，4℃備用；

步驟3：制備微生物懸液。包括接種微生物到相應的培養基上培養,培養好后用適量溶解劑洗脫菌苔或孢子，4500rpm，離心8min，棄上清，再用步驟2中溶解劑適量溶解重復清洗兩次，最后用步驟2溶解劑適量將菌泥溶解混勻,根據需要可十倍梯度稀釋至一定稀釋級。為了便于計算上述的適量均可采用3ml-10ml。

步驟4：將步驟3中稀釋級的菌液取適當量進行凍前計數；

步驟5：制備凍干菌懸液。結合步驟4的計數結果，步驟3中通過凍干存活率計算所需稀釋級別，該稀釋級的菌液與GS保護劑以一定比例混合均勻制成凍干菌懸液，該菌懸液包括葡萄糖0.1％-0.5％、蔗糖5％-10％、明膠0.5％-1.5％、胰蛋白胨1％-2％、大豆蛋白胨0.5％-1％、氯化鈉0.5％-1％、酵母粉0.2％-0.5％和活性炭0.2％-0.5％以及每50ul-100ul菌懸液凍干后存活菌數在100cfu-1000cfu的活菌；

步驟6：凍干成品。上述步驟5中凍干菌懸液進行制品凍干，凍干結束后，將制品在無菌環境下轉移至西林瓶中，每個西林瓶中含一個單位的圓柱形凍干制品，蓋上瓶塞，轉移回凍干機，在200mbar真空度下，25℃干燥1h，在該真空度下進行壓塞，然后放氣、出箱、壓鋁蓋。西林瓶可采用2ml的西林瓶。

定量菌株固態、冷凍干燥物使用時，需要溶解劑，溶解劑包括4℃備用氯化鈉0.8％-1％，磷酸氫二鉀0.5％-1％，胰蛋白胨0.5％-2％，酵母粉0.5％-2％的水溶液分裝后121℃滅菌15min制備的溶解液。作為優選，氯化鈉0.9％，磷酸氫二鉀0.8％，胰蛋白胨1％，酵母粉1％。

將可為圓柱狀凍干物倒入裝有N ml溶解劑的無菌容器中，溶解該制品，混 合均勻，每次取N/10ml用于檢測，N為1ml-10ml。菌含量小于100cfu，符合中國藥典規定，每瓶可使用十次。

微生物可包括藥品、食品、化妝品、醫療器械等檢測所用的常規菌。本實施案例中，微生物包括接種于相應培養基上的細菌或/和真菌。上述的細菌包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌或/和生孢梭菌。上述的真菌包括黑曲霉或/和白色念珠菌。步驟4具體包括將步驟3中菌懸液在無菌環境下分裝至圓柱狀模具中，每個模具裝量50ul，放入凍干機中，-40℃預凍2h，再以200mbar的真空度，-30℃的干燥溫度干燥8h，升溫至25℃繼續干燥，以壓升測試180sec內壓升范圍小于50mbar為干燥結束判斷點結束干燥過程，將干燥完成的制品進行凍后計數，計算得到凍干后的存活率。上述步驟6中最終每個凍干制品中含菌量為100cfu-1000cfu。

本發明中，上述步驟3中，為了便于計算，培養完成后用5ml溶解劑洗脫菌苔或孢子，4500rpm，離心8min，棄上清，再用步驟2中5ml溶解劑溶解，重復清洗兩次，最后用步驟2中5ml溶解劑將菌泥溶解混勻。用5ml來洗脫菌苔或孢子，也可以是6ml、7ml，但最終可十倍梯度稀釋到一個合適梯度后，取該梯度菌液與GS保護劑以一定比例混合均勻制成凍干菌懸液，該菌懸液包括葡萄糖0.1％-0.5％、蔗糖5％-10％、明膠0.5％-1.5％、胰蛋白胨1％-2％、大豆蛋白胨0.5％-1％、氯化鈉0.5％-1％、酵母粉0.2％-0.5％和活性炭0.2％-0.5％以及每50ul-100ul菌懸液凍干后存活菌數在100cfu-1000cfu的活菌。

本實施案例中以5ml溶解劑且稀釋液與保護劑比例為1：4為例，用5ml溶解劑洗脫菌苔或孢子，離心清洗后，得到洗凈的5ml菌液，取0.5ml該菌液，加入至4.5ml溶解劑中混勻，為十倍梯度稀釋，本次記10-¹稀釋液，取0.5ml 10-¹稀釋液加入至4.5ml溶解劑中，混勻，記10-²稀釋液，如此依次稀釋至10-¹⁰，取10-⁵、10-⁶、10-⁷、10-⁸、10-⁹、10-¹⁰，10-⁵之前的稀釋液含菌量一般較高，不予考慮計數，各取0.1ml稀釋液滴在已滅菌的平板上，用20ml該菌適宜生長的固體培養基(40℃左右液體狀態)傾注在平板上，輕搖混勻，即傾注法計數，每個稀釋級計兩塊平板。假如10-⁷的稀釋液計數結果是兩塊平板長菌分別為80和78個，可估計該稀釋級別含菌量為7.9*10²cfu/ml，則10-⁵稀釋液含菌量為7.9*10⁴cfu/ml，取10-⁵稀釋液1ml與4ml GS保護劑混勻，計算得該混合液凍干 前每50ul含菌量為790cfu。每個模具中滴加50ul該混合液，凍干。凍干后用1.1ml溶解劑溶解該凍干制品，取0.1ml稀釋液滴在已滅菌的平板上，用20ml該菌適宜生長的固體培養基(40℃左右液體狀態)傾注在平板上，輕搖混勻。假如計數結果是兩塊平板長菌分別為69和71個，可估計凍干后為每50ul含菌量為700cfu，存活率為700/790*100％＝88.6％。計算出合理的稀釋倍數是為了使凍干后每顆制品含菌量為100cfu-1000cfu。

合適的稀釋倍數可以反推得到，如凍后要求每顆制品含菌量為500cfu，經過實驗測得該菌在保護劑保護下存活率為80％，那么稀釋液與保護劑混合液凍干前每50ul含菌量應為500/80％＝625cfu，推算每5ml(即5000ul)混合液凍干前總含菌量為625cfu*100＝6.25*10⁴cfu，而稀釋液和保護劑比例為1:4，所以5ml混合液中有1ml為稀釋液，活菌都來自于這1ml稀釋液，所以合適的稀釋梯度的稀釋液中含菌量為6.25*10⁴cfu/ml，根據要求每顆凍干制品含菌量為100cfu-1000cfu，所以與保護劑混合的合適的稀釋液含菌量范圍為：1.25*10⁴cfu/ml-1.25*10⁵cfu/ml，具體要根據存活率來計算，不同凍干機即使使用同一凍干曲線，凍干存活率也有很大別差，但使用同一臺凍干機，同一凍干曲線來凍干制品，則凍干存活率偏差很小。

本實施案例中，為了便于計算，凍干前稀釋菌液和保護劑以1:4的比例為例,即每1ml稀釋液配比4ml保護劑，則保護劑為每1000ml中的A、B部分包括:

A部分：煮沸完全溶解于適量純化水的6.25g-18.75g明膠，煮沸完全溶解于適量純化水的62.5g-125g蔗糖，完全溶于適量純化水的12.5g-25g胰蛋白胨、6.25g-12.5g大豆蛋白胨、6.25g-12.5g氯化鈉、2.5g-6.25g酵母粉、2.5g-6.25g活性炭，將上述三者混合，調節pH值至7.2±0.2，121℃滅菌15min，4℃備用；

B部分：煮沸完全溶解于適量純化水的1.25g-6.25g葡萄糖，116℃滅菌15min，4℃備用。

其中A部分可定容為900ml，B部分可定容為100ml，當然A、B部分可任意定容只要滿足每保護劑1000ml中，能完全溶解上述A、B中相應的組分。

本發明定量菌株固態、冷凍干燥物穩定性檢測如下：

定量菌株固態、冷凍干燥物保存在-20℃條件下，每隔一個月進行計數。結果見下表一、二、三，計數結果單位：cfu/50ul

表一

表二

表三

從上表可明確看出，本發明制品在-20℃低溫保存條件下一年內有較高的存活率，均在90％以上，可以較好地保持制品中所含菌株的活力，保證制品質量。