一種重組VEGF與GnRH融合蛋白的基因工程菌的構建的制作方法
【專利摘要】本發明屬于基因工程領域，本發明公開提供了關于一種重組VEGF與GnRH的大腸桿菌菌株及制備方法。本發明提供的大腸桿菌菌株BL21(DE3)/VGD，CCTCC NO：M2016132。該工程菌含有重組質粒pET32a?VEGF?M2?GnRH3?hinge?MVP?NRLLLTG，質粒上有重組突變VEGF基因，該基因具有SEQ ID NO.1所示的基因序列。BL21(DE3)/VGD菌株經乳糖誘導，可高效表達重組蛋白VEGF I?M2?GnRH3?hinge?MVP?NRLLLTG。該重組蛋白預期可以提高機體對腫瘤細胞的免疫應答，打破免疫耐受，達到識別和殺滅腫瘤細胞的目的，對于抗腫瘤治療具有很好的臨床應用前景。CCTCC NO：M201613220150321
【專利說明】
一種重組VEGF與GnRH融合蛋白的基因工程菌的構建
技術領域
[0001] 在基因工程領域，本發明公開了一種新型融合蛋白重組工程菌及其構建方法，以 及該融合蛋白的純化。
【背景技術】
[0002] 重組質粒是指在基因工程的領域，將目的基因和載體結合成一個具有自我復制能 力的DNA分子，繼而轉化或轉染入宿主菌株或細胞，篩選出含目的基因的重組子。
[0003] 基因工程(Genetic engineering):是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和 微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分 子，然后導入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品，通過基因工程 技術可構建和表達具有多種功能的新型目的蛋白。
[0004] 腫瘤疫苗按抗原成分的類型可分為腫瘤細胞型疫苗、腫瘤抗原多肽及蛋白疫苗、 DNA疫苗和樹突狀細胞疫苗等。無論何種類型的腫瘤疫苗，其研制的關鍵都在于選擇合適的 針對腫瘤的靶抗原和提高免疫原性。
[0005] 腫瘤細胞會表達腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原，針對這些抗原發展起來的腫瘤 特異性免疫治療，是腫瘤生物治療的重要方法。
[0006] 腫瘤相關抗原（Tumor-associated antigen，TAA):指并非某一種腫瘤所特有，在 其他腫瘤細胞或正常細胞上也存在的抗原分子。正常細胞與腫瘤細胞僅在增殖中有量的差 異，因此稱為相關抗原。
[0007] 血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor)，即VEGF，是內皮特 異性的有絲分裂原，能增強內皮細胞的生存能力，促進有絲分裂，誘導毛細血管新生、增加 微血管通透性使腫瘤持續生長、促進細胞移行和抑制凋亡等多種功能。大多數腫瘤細胞均 高水平表達VEGF，而正常組織中僅腎、卵巢等少數臟器有較高水平的表達，因此VEGF是抗腫 瘤血管治療理想的靶部位。
[0008]目前應用單克隆抗體、小分子抑制物、可溶性受體等方法通過阻斷其信號轉導通 路或耗竭腫瘤細胞產生VEGF，抑制腫瘤血管生成，達到抑制腫瘤生長及轉移的作用。以腫瘤 血管生成為靶點的靶向治療，主要集中在抗VEGF治療上。目前針對VEGF途徑的基因療法，在 腫瘤的治療中前景比較樂觀。VEGFm突變體I是本實驗室用破傷風毒素兩個強T輔助表位 618-627和831-838替換hVEGFm的1-8和115-121兩個肽段。結果說明在保持半胱氨酸原有 二聚體結構的前提下，破傷風毒素兩個強T輔助表位hVEGF非關鍵殘基置換后，可有效提高 VEGF的免疫原性。
[0009] 促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)由下丘腦特定神 經元細胞合成，并以脈沖方式通過垂體門脈循環分泌到垂體前葉，與垂體細胞膜上高親和 力的GnRH受體(GnRHR)特異地結合，引發FSH和LH的合成與釋放，從而促進性腺中類固醇激 素的合成。通過誘導高滴度的抗GnRH-I抗體來中和機體內的GnRH-I，可抑制其與垂體上I型 GnRHR的結合，導致LH和FSH等促性腺激素釋放水平明顯下降，下調類固醇類激素的合成，降 低對腫瘤細胞的供應，對激素依賴性腫瘤有良好的治療效果。同時GnRH可通過抑制V EGF等 的表達下調腫瘤細胞誘導的血管再生作用以及調控或作用于生長因子，如在前列腺癌細胞 中GnRH-A具有抗EGF/TGFa系統作用，降低細胞分裂;也可能涉及細胞凋亡的誘發或者抑制 細胞內諸如P13/PKB等信號通道。因此GnRH及其受體是腫瘤治療的理想靶點。
[0010] GnRH-I是一種小分子半抗原，免疫原性很弱，單獨將其作為疫苗很難引起免疫應 答，因此本實驗室利用輔助T表位來提高GnRH-I的免疫原性。研究表明，麻疹病毒融合蛋白 序列中的288-302氨基酸片段是一個典型的T表位(SEIKGVIVRLEGVAK，下文均簡稱MVP)，可 用于人用疫苗而且不會產生明顯的針對該T表位的抗體。有研究表明，含有多拷貝線性連接 的自身肽序列蛋白的免疫原性可以得到極大的提高，因而，本實驗室將編碼三段首尾相連 的GnRH-I的核苷酸片段克隆入高效表達載體。還有研究表明，半抗原的二聚體能產生很強 的免疫原性。人IgGl鉸鏈區（hinge region)寡肽片段226-232/226'-232'（CPPCPAP/ CPPCPAP)是天然免疫蛋白的樞軸。本實驗將與DnaK多肽結合結構域有著高度親和力的多肽 片段NRLLLTG融合在先前所構建的GnRH-I多肽疫苗融合蛋白的C-端。因此，本設計是在編碼 GnRH-I重復序列和MVP的核苷酸序列之間引入該寡肽片段的相應核苷酸序列，希望GnRH-I 能藉此形成二聚體，增強免疫原性。
[0011]由于單獨用VEGF或GnRH免疫原性相對較低，且從多個位點共同作用于腫瘤已經成 為趨勢。本發明將VEGFmI_M2基因同GnRH基因連接起來，組建pET32a-VEGF I-M2-GnRH3-hinge-MVP-Dnak binding site重組質粒，誘導表達融合蛋白，將其作為疫苗刺激機體產生 主動免疫，打破免疫耐受，產生針對VEGF和GnRH特異性肽段的抗體，從而抑制腫瘤的生長。
【發明內容】
[0012] 本發明公開一種表達重組VEGF融合蛋白的基因工程菌。
[0013] 本發明的一個目的是提供該重組菌的制備方法，方法簡便，易于操作。
[0014] 本發明的另一個目的是公開該重組蛋白的純化方法。
[0015] 在本發明的第一個方面，該大腸桿菌菌株命名為Escherichia coli BL21(DE3)/ VGD: pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，菌株已提交中國典型培養物保藏中心，保 藏地址：中國、武漢、武漢大學。保藏日期：2015年3月21日，保藏編號為CCTCC NO:M2016132， 分類命名為Escherichia coli BL21/pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，其細胞 中含有重組質粒pET32a-VEGF-M2-GnRH 3-hinge-MVP-NRLLLTG，質粒中含有SEQ ID NO. 1 所示 的重組突變VEGF基因序列。
[0016] 在本發明的第二個方面，提供了該重組質粒的制備方法，其技術路線詳述如下：
[0017] 1 ·重組質粒pET32a-VEGF I-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG及相應基因工程菌的構 建
[0018] 根據本實驗室已有的關于重組質粒pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NR LLLTG和pET28a-VEGF I-M2的序列信息，利用引物設計軟件Primer 5和01igo7來設計引物 VI、V2。上游引物VI中引入Nco I，下游引物V2中引入BamH頂每切位點以及GSGSG連接肽序 列。采用PCR技術從pET28a-VEGF I-M2質粒中克隆得到基因 VEGF I-M2-GSGSG。通過Nco I和 BamH I雙酶切、T4連接酶連接和轉化技術將PCR的產物VEGF I-M2-GSGSG插入pEDGD質粒載 體的相應酶切位點中，得到中間轉化子pET28a-VEGF-M 2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，再通過 N co I和Hind III雙酶切、T4連接酶連接，將目的基因插入pET32a組成重組質粒pE T32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，將重組質粒轉化大腸桿菌E.coli BL21獲得需要的重 組基因的工程菌。
[0019] 2.融合蛋白的誘導表達
[0020] 將重組工程菌進行活化，接種至含氨芐霉素的LB培養基中震蕩培養過夜，按1:100 轉接于新鮮LB培養液中，37°C培養至A600值為0.5-0.8時，加入乳糖(終濃度7mM)進行誘導 表達，7h后離心收取菌體沉淀，進行15%SDS-PAGE分析，觀察目的蛋白條帶位置和表達量。
[0021] 3.融合蛋白的分離純化
[0022] 收集菌體，每克濕菌體加入10mL菌體裂解緩沖液溶解，菌體超聲裂解后，離心收集 上清。經硫酸銨分級沉淀，篩選出目的蛋白主要沉降時的硫酸銨飽和濃度并收集此時的沉 淀。將沉淀復融于離子交換液中，4°C攪拌至充分溶解，離心收集上清。上清裝于8000-14000KDa的透析袋中，對離子交換液于4°C充分透析，離心棄沉淀，上清液過陰離子交換柱 DEAE-cellulose做進一步純化，用濃度梯度為0-1M NaCl層析緩沖液梯度洗脫，收集洗脫 峰，檢測合并目的蛋白峰組分，蒸餾水充分透析后凍干保存。
【附圖說明】
[0023] 圖1重組質粒構建原理示意圖。
[0024] 圖2 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物VEGFmI-M2-GSGSG基因的結果。
[0025] Lanel :Protein Marker，Lane2:VEGFmIHVl2-GSGSG基因
[0026] 圖3質粒pET28a-VEGFmI-M2_GSGSG基因的正向測序圖
[0027] 圖4 重組質粒pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG(pED⑶）基因的正向 測序圖。
[0028] 圖5 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG目的基因的結 果。
[0029] Lane 1: Protein Marker，Lane2:重組質粒，Lane3:單酶切驗證，Lane4:雙酶切得到 V⑶基因
[0030] 圖 6 重組質粒 pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG(pEDVG2)的基因正向測 序圖。
[0031] 圖7 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG基因的結果。
[0032] Lane 1: Prote in Marker，Lane2:重組質粒，Lane3:單酶切驗證，Lane4:雙酶切得到 V⑶基因
[0033] 圖8 重組質粒pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG(pET32a-VG)的基因正 向測序圖。
[0034]圖9 15%SDS-PAGE電泳檢測重組菌經乳糖誘導表達融合蛋白的誘導曲線。
[0035] Lanel :Protein Marker，Lane2:誘導前的全菌蛋白樣品，Lane3_10:誘導后l_8h每 個小時的全菌蛋白樣品
[0036] 圖10 15%SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白破碎后圖。
[0037] Lanel: Protein Marker，Lane2 :誘導前全菌蛋白，Lane3 :誘導后6h全菌蛋白， Lane4:超聲破碎后離心上清，Lane5:超聲破碎后沉淀 [0038]圖11 15%SDS_PAGE電泳檢測硫酸銨飽和濃度的選擇
[0039] 1^1161:?1'(^6；[11]\^^61'，1^1162:誘導前全菌蛋白，1^1163:0~5%硫酸銨飽和濃度 透，Lane4:5 %~10 %硫酸銨飽和濃度，Lane5:10 %~20 %硫酸銨飽和濃度，Lane6:20 %~ 30 %硫酸銨飽和濃度，Lane7:30 %~40 %硫酸銨飽和濃度，Lane8:40 %~50 %硫酸銨飽和 濃度，Lane9:50 %~60 %硫酸銨飽和濃度
【具體實施方式】
[0040] 材料
[0041 ] (1)菌株
[0042]載體PET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，Escherichia coli B L21 (DE3)，菌株pET28a-VEGFmI_M2均為本實驗室保存。
[0043] (2)工具酶和試劑
[0044]分子克隆工具酶為Fermentas公司產品；質粒抽提試劑盒為上海捷瑞生物科技有 限公司;產物純化試劑盒以及PCR膠回收試劑盒為上海生工生物科技有限公司的產品。 [0045] (3)培養基
[0046] LB培養基，配方見參考文獻Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989〇
[0047] 本說明書所提及的方法中質粒提取、PCR反應、內切酶酶切、PCR產物的回收、連接 酶連接和轉化大腸桿菌，這些都是基因工程研究領域的常規操作方法，具體參見Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory M anual 2nd ed.NY：CoId Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp·16_340〇
[0048] 實施例 1 pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG 基因的克隆
[0049] 根據本實驗室已構建的關于pET28a-VEGFmI_M2的序列信息，利用引物設計軟件 卩1'；[11161'、01180分別設計兩對引物￥1、￥2:
[0050] VI：57-CATGCCATGGACATCATCGACGACTTCACTA-37 [0051 ] V2：57-CGGGATCCACCGCTGCCGCTACCCTTGTTGT-37
[0052] 上游引物VI中引入酶切位點Nco I，下游V2中引入酶切位點BamH I以及柔性肽 GSGSG。用質粒提取試劑盒提取質粒pET28a-VEGFmI_M2和質粒pET28a-(ansB-C)-GnRH 3-hinge-MVP-NRLLLTG。利用引物V1、V2克隆VEGFmI-M2-GSGSG基因，PCR反應體系見表1，反應 參數見表2。
[0053]表 1 VEGF I-M2-GSGSG PCR反應體系
[0054]
[0055] 表2 VEGF I-M2-GSGSG PCR反應參數
[0056]
[0057] 0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物(參見說明書附圖2)，條帶位置與預期的534bp 一致。
[0058] 通過切膠回收獲得目的片段VEGFmI-M2-GSGSG，將目的片段和pET28a-(ansB-C)- GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG載體質粒分別經Nco I、BamH I雙酶切，雙酶切反應體系見表3、 表4。
[0059] 表3 VEGF I-M2-GSGSG基因雙酶切反應體系
[0060]
[0061]
[0062]表4 pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG雙酶切反應體系
[0063]
[0064] 酶切產物通過PCR產物純化試劑盒純化，瓊脂糖凝膠電泳分別回收目的基因片段 與載體基因片段后用E. co 1 i DNA連接酶4 °C連接，用冷CaCl2法制備大腸桿菌BL21的感受態 細胞，將酶連產物轉化感受態細胞后涂布到含卡那霉素的LB固體培養基上，37 °C過夜培養 后挑取單菌落，將單菌落接種至LB液體培養基中，培養過夜，提取質粒，分別通過PCR、單酶 切和雙酶切等方法初篩陽性克隆，并送至生工測序公司進行測序，測序結果經軟件比對后 完全正確(參見說明書附圖4)。
[0065] 通過切膠回收獲得目的片段，將目的片段VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NR LLLTG和 pET32a載體質粒分別經Nco I、Hind III雙酶切，雙酶切反應體系見表3、表4。
[0066] 表3 VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG基因雙酶切反應體系
[0067]
[0068] 表4空載體pET32a雙酶切反應體系
[0069]
[0070] 酶切產物通過PCR產物純化試劑盒純化，瓊脂糖凝膠電泳分別回收目的基因片段 與載體基因片段后用E. co 1 i DNA連接酶4 °C連接，用冷CaCl2法制備大腸桿菌BL21的感受態 細胞，將酶連產物轉化感受態細胞后涂布到含氨芐霉素的LB固體培養基上，37 °C過夜培養 后挑取單菌落，將單菌落接種至LB液體培養基中，培養過夜，提取質粒，通過PCR、單酶切和 雙酶切等方法初篩陽性克隆，并送至生工測序公司進行測序，測序結果經軟件比對后完全 正確(參見說明書附圖8)。
[0071] 實施例2 VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG基因在大腸桿菌中的表達及培養
[0072] 重組菌以1 %接種量在液體LB培養基試管中37°C振蕩培養過夜，再以1 %的接種量 轉接搖瓶大批培養，培養4h后加入終濃度為5mM乳糖誘導表達，誘導6h后收集菌體，留樣進 行SDS-PAGE分析。融合蛋白在誘導后6h達到穩定的最大表達量，通過Bandscan軟件分析融 合蛋白的表達量可達菌體總蛋白量的65% (參見說明書附圖9)。
[0073] 實施例3融合蛋白的初步分離純化
[0074] 挑選高表達量菌株，接種于LB培養基中，37 °C過夜培養;過夜培養液轉接入LB培養 基，37 °C擴大培養，選取最優發酵條件獲得發酵菌體。5000r/min離心15min，上清及沉淀均 留樣。將沉淀用配制好的菌體裂解液（10mL/g菌體)溶解，超聲裂解菌體。12000r/min離心 20min，收集上清及沉淀均留樣標記。SDS-PAG E電泳結果顯示目的蛋白主要存在于菌體上 清中，故可判斷融合蛋白為可溶性表達(參見說明書附圖10)。
[0075] 實施例4可溶性目的蛋白的硫酸銨分級沉淀
[0076] 取重組菌裂解液離心后上清于冰浴中邊攪拌邊加入研細的硫酸銨粉末至相應飽 和度(飽和度分別為5 %，10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60% )，加入速度應緩慢，以液體中不 出現硫酸銨固體為宜。達到相應飽和度后4°C靜置lh，供蛋白質充分沉淀，12000r/min離心 20min，每一級飽和度各取上清和沉淀制備樣品，進行SDS-PAGE檢測，根據蛋白條帶分析目 的蛋白集中沉淀的硫酸銨飽和度。選擇目的蛋白集中沉淀的硫酸銨飽和濃度時收集沉淀復 融于離子交換液中，（25mM Tris · HCl，pH8.0)中，復溶時須加入1%(v/v)β-巰基乙醇。將復 溶的蛋白溶液于4°C對離子交換緩沖液透析過夜，再于4°C，12000r/min離心20min，棄沉淀， 上清用DEAE-52陰離子交換樹脂進行進一步分離純化。
[0077]實施例5 DEAE-52陰離子交換層析
[0078] 本實驗采用的DEAE52是弱酸型陰離子交換劑，將DEAE-52用NaOH、HCl和NaOH分別 處理后用蒸餾水將其洗至中性，再將DEAE-52裝入層析柱中，層析柱上端進液口連接恒流 栗，下出口連接核酸蛋白檢測儀，利用離子交換緩沖液(pH8.0,20mM Tris · HC1)進行層析 柱的平衡，平衡完畢后以lmL/min的速度進行蛋白溶液的上樣操作，上樣后重復平衡操作， 再用NaCl(O-lM)進行梯度洗脫，收集洗脫峰留樣，進行SDS-PAGE電泳分析。
[0079]實施例6脫鹽凍干
[0080]收集蛋白純度較高的洗脫液，4 °C對R0水透析過夜，將透析后的洗脫液在凍干機中 凍干，刮取蛋白干粉冷凍保存。
[0081]除上述事實外，本發明還可以有其他實施方式，凡采用等同替換或等效變換性的 技術方案，均落于本發明要求的保護范圍。
【主權項】
1. 一種生產重組蛋白VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG的大腸桿菌菌株，其特征在于 大腸桿菌菌株Escherichia coli.BL21(DE3)/VGD，保藏編號：CCTCC N0:M2016132。2. 根據權利要求書1所述的該大腸桿菌菌株BL21 (DE3)/VGD，其特征在于:大腸桿菌細 胞中含有重組質粒 pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG。3. 根據權利要求書2所述的該大腸桿菌菌株BL21(DE3)/V⑶中重組質粒pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，其特征在于：含有重組的VEGF-M2-GnRH 3-hinge-MVP-NRLLLTG，可表達融合蛋白，其具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。4. 一種制備權利要求書1所述的該大腸桿菌菌株的方法，它包括以下步驟： (I)用質粒提取試劑盒提取質粒 pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG 和 pET28a-VEGF I-M2,通過PCR方法擴增出目的片段VEGF I-M2-GSGSG。 (Π )用限制性內切酶Nco I、BamH I切割VEGF I-M2-GSGSG和pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG質粒，用E. coli DNA連接酶4°C連接過夜，將其轉化大腸桿菌菌株，獲得 含質粒 pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG 的菌株。 (ΠI)用質粒提取試劑盒提取質粒pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG和質粒 pET32a，用限制性內切酶Nco I、Hind III切割質粒pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG和質粒pET32a，用E.coli DNA連接酶4°C連接過夜，將其轉化大腸桿菌菌株，獲得 BL21(DE3)/VGD 菌株。 (IV)鑒定重組質粒:使用PCR法、和單酶切、雙酶切方法進行驗證，將重組菌株進行測序 驗證。5. 根據權利要求3所述的一種新型融合蛋白VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，其特 征在于：該基因表達的融合蛋白實際分子量約為27kDa，其N端為VEGF I和M2(Hsp70(407-426)的兩段串聯重復序列），C端為三段串聯重復的GnRH序列及IgG的鉸鏈區及麻疹病毒融 合蛋白序列中的288-302氨基酸片段MVP，N端和C端之間利用GSGSG柔性肽連接。6. 根據權利要求5所述的VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG肽的重組方法，其特征在 于:包含抗腫瘤疫苗的抗原表位VEGF、GnRH，及分子內佐劑M 2，具有更強的抗腫瘤功能。7. -種VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG肽的制備方法，其特征在于，該方法包含步 驟： (I) 根據權利要求4所述步驟構建宿主菌 (II) 通過乳糖誘導，超聲破碎，硫酸銨分級沉淀來初步獲得重組蛋白 (III) 通過DEAE-52離子交換層析分離出VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，該融合蛋 白純度可達SDS-PAGE電泳純。
【文檔編號】C12R1/19GK106085932SQ201610343170
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月19日
【發明人】曹榮月, 葉佳, 井亮亮, 李巖, 李曼曼, 苗梓韜, 劉淑君
【申請人】中國藥科大學