雙親性硅烷包覆的水溶性復合納米材料及其應用
【專利摘要】一種雙親性硅烷包覆的水溶性復合納米材料及其在氧氣傳感、熒光標記、光動力治療等方面的應用，屬于生物材料技術領域。本發明以油性納米粒子作為內核，使用雙親性硅烷進行包覆，使油性納米粒子變為水溶性，并且保留了內核的性質，譬如磁性納米材料的超順磁性。本發明在實現油性納米粒子變成水溶性的同時，將不同的功能性油性分子(譬如具有氧氣傳感功能的鉑(Ⅱ)meso?四(五氟苯)卟吩、具有熒光標記功能的香豆素6、具有光動力治療功能的二氫卟吩e6等的一種以上)載入到硅烷與油性納米粒子形成的夾層中，從而實現了復合納米材料的多功能。功能性油性分子與油性納米粒子的質量比例不宜超過0.3：1。
【專利說明】
雙親性硅烷包覆的水溶性復合納米材料及其應用
技術領域
[0001]本發明屬于生物材料技術領域，具體涉及一種雙親性硅烷包覆的水溶性復合納米材料及其在氧氣傳感、熒光標記、光動力治療等方面的應用。
【背景技術】
[0002]多功能復合納米材料受到了廣泛的關注，由于它們的小尺寸優勢，以及多功能特點，開發新型復合納米材料將對癌癥診斷與治療提供很大的幫助。為了能將復合納米材料應用于生物體內，首先就要保證其良好的水溶性以及生物相容性，這樣才能最大程度降低材料對細胞活性的影響。并且盡可能使材料具有多種不同的功能，譬如熒光標記，載藥，傳感，光熱治療及光動力治療。
[0003]但是，一些尺寸均勻的納米材料往往是在油相條件下合成的，這些材料的表面就會有很多親油性基團，使得整個納米材料不易在水中穩定存在，這樣便很大程度上限制了它們在生物領域上的應用。一些傳統的包覆方法，如二氧化硅包覆，其操作步驟繁瑣，并且形成水溶性納米顆粒尺寸較大。而較大尺寸的納米材料，不易被細胞內吞，這就給其生物應用造成了一定困難。為此，尋求一種簡單的包覆方法，使其在幾乎不增加納米材料尺寸的前提下，使得油性納米粒子具有親水性，同時可以載入其他功能性分子，就顯得尤為重要。
【發明內容】
[0004]為解決上述問題，本發明的目的是提供一種雙親性硅烷包覆的水溶性復合納米材料及其生物應用。
[0005]雙親性硅烷，指的是同時含有疏水的烷基和親水的甲氧基構成硅烷，譬如正丙基三甲氧基硅烷、正己基三甲氧基硅烷、正辛基三甲氧基硅烷、十二烷基三甲氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷，它們可以與極性溶劑和非極性溶劑互溶。在這里，我們采用雙親性硅烷來包覆油性納米粒子的原因是，雙親性硅烷一端的疏水烷基鏈可以和油性納米粒子表面的疏水基團作用，而另一端的親水性甲氧基，可以露在外面，使復合納米材料可以穩定地存在于水中。
[0006]本發明以油性納米粒子作為內核，使用雙親性硅烷進行包覆，使油性納米粒子變為水溶性，并且保留了內核的性質，譬如磁性納米材料的超順磁性。本發明同時將不同的功能性油性分子(譬如具有氧氣傳感功能的鉑(Π )meS0-四(五氟苯)撲吩、具有熒光標記功能的香豆素6、具有光動力治療功能的二氫卟吩e6等的一種以上)載入到硅烷與納米粒子之間的夾層中，從而實現復合納米材料的多功能。
[0007]本發明所述的一種雙親性硅烷包覆的水溶性復合納米材料，是由如下步驟制備:
[0008](I)將油性納米粒子、雙親性硅烷分別配置成濃度為I?10mg/mL的四氫呋喃溶液，之后將兩種溶液按I: 0.2?5的體積比例進行混合;再向該混合溶液中加入功能性油性分子的四氫呋喃溶液;其中，功能性油性分子與油性納米粒子的質量比為O?0.3:1 ；
[0009](2)將I?5mL步驟(I)得到的混合溶液超聲5?30分鐘使其混合均勻，然后注入到5?20mL的氨水溶液(pH=8?1)中，水解反應I?5小時；
[0010](3)將步驟(2)得到的混合溶液裝入截留分子量為8000?14000的透析袋中，透析24?48小時以除去四氫呋喃，從而得到本發明所述的雙親性硅烷包覆的水溶性復合納米材料。
[0011]需注意的是，雙親性硅烷與油性納米粒子之間形成的疏水層空間有限，載入的功能性油性分子與油性納米粒子的質量比例不宜超過0.3:1。過多的話，就會破壞結構，導致油性納米粒子和功能性油性分子聚集而產生沉淀。
[0012]油性納米粒子包括但不限于四氧化三鐵納米粒子，硫化銅納米粒子，鎢酸銫納米粒子。功能性油性分子包括但不限于鉑(II)meso-四(五氟苯)Π卜吩、香豆素6、二氫卟吩e6、紫杉醇。
【附圖說明】
[0013]圖1:為實施例1制備的水溶性磁性復合納米材料的透射電鏡照片，其尺寸約為10nm0
[0014]圖2:為實施例1制備的水溶性磁性復合納米材料對T2弛豫時間的磁共振成像照片，說明合成的磁性復合納米材料具有很好的超順磁性。
[0015]圖3:為實施例1制備的水溶性磁性復合納米材料與測試單線態氧探針(9，10_蒽基-雙(亞甲基)二丙二酸作，ADMA)混合后，探針在260nm處的吸收值，會隨著紅光輻照時間增長而降低。說明在紅光輻照下，有單線態氧不斷產生，破壞了單線態氧探針的結構，導致其在260nm處的吸收值降低。
[0016]圖4:A549細胞在光動力治療前后的共聚焦成像照片。左圖(下圖為上圖的局部放大圖)為治療前，細胞被磁性復合納米材料所標記，可以清楚地看到細胞質發出綠光(起源于熒光染料香豆素6)，右圖(下圖為上圖的局部放大圖)為使用635nm激光照射I分鐘后，向其中加入溴化乙錠染料對死細胞進行染色，染色時間為15分鐘。可以看到被照射過的細胞，其細胞核可以被溴化乙錠染成紅色，而周圍沒有被照射過的細胞，其細胞核不會被染色。
[0017]圖5:消化后的A549細胞在外加磁場的作用下，在不同時刻的運動軌跡照片。該圖表示了當(a)T = 0，(b)T = 2s, (c)T = 4s, (d)T = 6s, (e)T = 8s，和(f )T= 1s時，細胞的運動軌跡。
[0018]圖6:為實施例2制備的水溶性磁性復合納米材料，在392nm激發光的激發下的發射光譜圖；其發射光譜在650nm處的強度值會隨著氧氣含量的增多而降低。
[0019]圖7:為Stern-Volmer曲線，表明該磁性復合納米材料具有很好的氧氣傳感性能。
[0020]圖8:為實施例3制備的水溶性硫化銅復合納米材料的透射電鏡圖，其尺寸約為1nm0
[0021]圖9:為實施例4制備的水溶性鎢酸銫復合納米材料的透射電鏡圖，其尺寸為6?15nm0
【具體實施方式】
[0022]為更好地理解本發明，下面將通過具體的實施例進一步說明本發明的方案，本發明的保護范圍應包括權利要求的全部內容，但不限于此。
[0023]實施例1
[0024]首先，按照共沉淀法合成了四氧化三鐵納米粒子，為了增加其穩定性，對其表面進行了油酉愛包覆(Wang，J.，et al.Remote manipulat1n of micronanomachinescontaining magnetic nanoparticles.0ptics Letters 34,581-583(2009))。
[0025]將制備好的油性四氧化三鐵納米粒子和正辛基三甲氧基硅烷(購買于sigma公司)分別配置成5mg/mL的四氫呋喃溶液，之后分別取ImL上述兩種溶液進行混合。
[0026]向上述混合溶液中滴入0.02mL、濃度為lmg/mL的香豆素6(購買于sigma公司)的四氫呋喃溶液和0.2mL、濃度為lmg/mL的二氫卩卜吩e6(購買于sigma公司)四氫呋喃溶液。
[0027]將上述混合溶液超聲10分鐘，使其混合均勻，之后將其注入到1mL的氨水溶液(pH值為9)中，進行水解反應，持續3h。
[0028]將上述混合溶液裝入透析袋(參數:截留分子量為8000?14000)中，進行24小時的透析，將四氫呋喃除去，從而得到本發明所述的雙親性硅烷包覆的水溶性磁性復合納米材料，產物濃度是0.836mg/mL0
[0029]該磁性復合納米材料不僅具有超順磁性，可以進行細胞移動和分離，并且具有熒光標記和光動力治療的功能。
[0030]參見圖1，該磁性復合納米材料的尺寸約為10nm，類似球形，可以看到其由很多小的四氧化三鐵納米粒子構成。這是由于四氧化三鐵納米粒子會相互吸引，發生團聚。
[0031 ]參見圖2，探索了磁性復合納米材料的順磁性。通過對磁性復合納米材料的T2弛豫時間進行磁共振成像，可以看出隨著復合納米材料濃度的不斷增加，其成像不斷變暗，對比度不斷提高。圖2(1)?(6)分別是磁性復合納米材料濃度為0.9、0.45、0.225、0.1125、
0.056、0.028mg/mL時的磁共振成像圖片，說明了該磁性復合納米材料可以作為磁共振成像的造影劑。
[0032]參見圖3，探索了磁性復合納米材料的光動力治療功能。首先，取3mL本實施例制備的磁性復合納米材料的水溶液(其濃度是0.836mg/mL)，將其濃度稀釋到0.45mg/mL。將9，10-蒽基-雙(亞甲基)二丙二酸(單線態氧檢測探針，購買于sigma公司)加入到磁性復合納米材料中，其濃度為lOppm。由于光敏劑在紅光(波長范圍620?630nm)福照下，會產生單線態氧。而單線態氧具有很強的氧化性，會對9，10-蒽基-雙(亞甲基)二丙二酸這種單線態氧檢測探針造成結構上的破壞。加入這種探針后，探針的吸收峰會隨著紅光輻照磁性復合納米材料時間的增加而降低，說明有單線態氧產生，破壞了探針的結構。
[0033]參見圖4，我們進一步探究了磁性復合納米材料在細胞內部的熒光標記功能和光動力治療功能。首先將1*106個A549細胞(懸浮在2mL培養基中)，接種在共聚焦培養皿上，之后將其放在孵育箱中孵育24h，加入含有本實施例制備的磁性復合納米材料(100yg/mL)的培養基(HyClone RPMI Medium Modif ied)，再次孵育24h。之后使用磷酸緩沖鹽溶液將細胞反復沖洗三次，并將其放在共聚焦顯微鏡下進行共聚焦熒光成像。在405nm的激發下，可以看到細胞質發出明亮的綠光，該發射光來源于磁性復合納米材料中香豆素6的發光。之后，使用635nm激光器進行輻照，持續時間為lmin，再使用溴化乙錠染料對其進行染色，染色時間為15min。使用共聚焦系統配有的488nm激光器來激發溴化乙錠染料，可以明顯看出被635nm激光輻照過的地方，其細胞核會被溴化乙錠染色，進而發出明亮的紅光，而周圍的活細胞則發出明亮的綠光(香豆素6的發光)。由此證明，通過選用合適的激發光，可以激活光敏劑，使其產生單線態氧。由于單線態氧具有很強的氧化性，可以對細胞產生很大傷害，進而誘導細胞凋亡(MacDonald, I.J.&Dougherty ,T.J.Basic principles of photodynamictherapy.Journal Of Porphyrins And Phthalocyanines 5，105-129(2001))。
[0034]參見圖5，將貼壁的A549細胞使用胰酶溶液(購買于Solarb1公司)進行消化，并使用培養基將細胞吹散，置于共聚焦顯微鏡下觀察。隨后加上外加磁場，并記錄不同時刻的細胞運動圖像，并將圖像進行疊加后，可以清楚地看到不同時刻對應的細胞運動軌跡。
[0035]實施例2
[0036]重復實施例1，其不同之處在于，這次載入的功能性油性分子為具有氧氣傳感功能的鈾(Π )meso-四(五氟苯)卩卜吩(購買于sigma公司)。將其配成lmg/mL的四氫呋喃溶液，取0.1mL加入到與實施例1中相同條件的油性四氧化三鐵納米粒子和雙親性硅烷混合液中，其余步驟與實施例1相同。所得產物濃度是0.835mg/mLo
[0037]參見圖6，當使用392nm激發光激發磁性復合納米材料時，由于其含有鉑(Π)meso-四(五氟苯)P卜吩，會在發射紅光，其峰值位置在650nm處。并且該處發射光的強度值隨著周圍的氧含量變化而發生改變。當使用氣體混配器配置不同含氧量的混合氣體時，(氧氣的體積分數分別為O、20、40、60、80、100 % )，將其通入到密封的比色皿中，每次持續30分鐘，使得比色皿內的氣體達到平衡狀態。后將比色皿中的磁性復合納米材料進行熒光發射光譜的測試。在392nm激發光的激發下，其發射光譜在650nm處的強度值會隨著氧含量的增加而逐漸降低。
[0038]參見圖7，可以繪制相應的Stern-Volmer曲線，表明該雙親性硅烷包覆的磁性復合納米材料具有很好的氧氣傳感性能。這種簡單的包覆方法，不僅可以使油溶性納米粒子變為水溶性，而且可以載入其他功能性油性分子，合成多功能納米復合材料。
[0039]實施例3
[0040]重復實施例1，將實施例1中的油性四氧化三鐵納米粒子換成油性硫化銅納米粒子，這里硫化銅納米粒子的合成步驟是參照該文獻進行合成的(Liu，L.，etal.Controllable Transformat1n from Rhombohedral Cul.8S Nanocrystals toHexagonal CuS Clusters:Phase_and Composit1n-Dependent PlasmonicProperties.Chemistry of Materials 25，4828_4834(2013)) D在這里，只對油性硫化銅納米粒子完成了水溶性的修飾，并沒有向硅烷與硫化銅納米粒子的夾層中加入功能性油性分子。所得產物濃度是0.833mg/mL。
[0041]參見圖8，為合成后雙親性硅烷包覆的水溶性硫化銅復合納米材料的透射電鏡圖，其尺寸約為I Onm O
[0042]實施例4
[0043]重復實施例3，將實施例3中的油性硫化銅納米粒子換成油性鎢酸銫納米粒子，這里媽酸銫納米粒子的合成步驟是參照該文獻進行合成的(Mattox，T.M.，Bergerud，A.，Agrawal,A.&Milliron,D.J.1nfluence of Shape on the Surface Plasmon Resonanceof Tungsten Bronze Nanocrystals.Chemistry of Materials26，1779-1784(2014))。在這里，只對油性鎢酸銫納米粒子完成了水溶性的修飾，并沒有向硅烷與鎢酸銫納米粒子的夾層中加入功能性油性分子。所得產物濃度是0.833mg/mL。
[0044]參見圖9，為合成后雙親性硅烷包覆的水溶性鎢酸銫復合納米材料的透射電鏡圖，其尺寸為6?15nm。
[0045]本發明的上述實施例是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對本發明的實施方式的限定，對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上可以做出一些變動，都可以達到一定效果。但凡是與本發明的技術方案有相關性的，仍處于本發明的保護范圍之列。
【主權項】
1.一種雙親性硅烷包覆的水溶性復合納米材料，其特征在于:是由如下步驟制備: (1)將油性納米粒子、雙親性硅烷分別配置成濃度為I?10mg/mL的四氫呋喃溶液，之后將兩種溶液按1:0.2?5的體積比例進行混合;再向該混合溶液中加入含有功能性油性分子的四氫呋喃溶液;其中，功能性油性分子與油性納米粒子的質量比為O?0.3:1 ； (2)將I?5mL步驟(I)得到的混合溶液超聲5?30分鐘使其混合均勻，然后注入到5?20mL、pH=8?1的氨水溶液中，水解反應I?5小時； (3)將步驟(2)得到的混合溶液裝入截留分子量為8000?14000的透析袋中，透析24?48小時以除去四氫呋喃，從而得到雙親性硅烷包覆的水溶性復合納米材料。2.如權利要求1所述的一種雙親性硅烷包覆的水溶性復合納米材料，其特征在于:油性納米粒子為四氧化三鐵納米粒子、硫化銅納米粒子或媽酸銫納米粒子。3.如權利要求1所述的一種雙親性娃燒包覆的水溶性復合納米材料，其特征在于:功能性油性分子為鈾(n)meS0-四(五氟苯)Π卜吩、香豆素6、二氫Π卜吩e6或紫杉醇。4.權利要求1?3任何一項所述的一種雙親性硅烷包覆的水溶性復合納米材料在氧氣傳感、熒光標記或光動力治療方面的應用。
【文檔編號】C09K11/02GK105950132SQ201610247372
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月20日
【發明人】董彪, 徐詩函, 許紅威, 宋宏偉, 白雪, 徐琳, 孫雪珂
【申請人】吉林大學