包覆TiO2的上轉換納米顆粒均勻核殼結構及其應用
【專利摘要】本申請公開了一種由半導體材料層包覆的上轉換納米顆粒(UCN)。UCN核作為納米轉換器，將近紅外(NIR)光轉換為可見光和/或紫外(UV)光，半導體殼作為光催化劑。當被NIR光激發時，UCN將NIR光上轉換為不同波長的UV光和/或可見光。UV發射光和包覆TiO2的吸收波長的光譜重疊將TiO2層激活，生成細胞毒性活性氧類(ROS)，所述細胞毒性活性氧類可用于治療癌細胞的光動力學療法中。通過改變納米粒子的包覆層，例如使用聚合物和分散穩定劑，可增加納米顆粒的穩定性和攝取。
【專利說明】包覆T i 02的上轉換納米顆粒均勻核殼結構及其應用
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求于2014年1月6日提交的，編號為61/923858的美國臨時申請的權益。通 過引用，上述專利申請的全部教導結合于此。
【背景技術】
[0003] 傳統的熒光物質主要是基于"下轉換熒光"：當被高能量的光，通常在紫外(uv)-短 波長的可見光范圍內激發時，這些熒光物質發射低能量的熒光。與下轉換相反的效應也是 存在的，即所謂的上轉換過程。上轉換發光源自一種現象，其中，在反斯托克斯發光過程中， 通常在近紅外(NIR)范圍內的低能量的光被轉換為更短波長范圍內的較高能量的光。上轉 換熒光材料通常由具有主晶格的納米晶體制成，例如摻雜Yb 3+、Er3+、Tm3+等三價鑭系離子的 1^?3、￥? 3、￥203、1^?〇4或似￥?4。一個重要的特征是其典型的狹窄的光致發光光譜 1，通過摻雜 不同濃度的鑭系離子2,可以精細地調整發光顏色，使得被980nm NIR光激發后得到在UV、可 見光和NIR光波范圍內變化的顏色。此外，上轉換過程比雙光子吸收的效率更高，從而便于 使用低廉市售的連續波(CW)激光二極管 3進行激發。這些上轉換熒光材料的另一個獨特的 特征是:其優異的光穩定性外加對細胞及脆弱的蛋白質低的光子損害能力(NIR射線是無害 的）使長時間活體成像和光活化成為可能 4'5。同樣引人注意的是使用這些材料時接近零的 背景熒光，因為大多數的其他材料，包括生物分子，不具有這種上轉換性質 6。如果將這種無 背底特性與其高量子產率結合3，上轉換熒光材料可能是一種非常有前途的發光探針，它可 以以驚人的檢測靈敏度追蹤微量目標分子。另外，用于激發這些材料的NIR光可深入組織 中 7,進而提供無創成像和深層組織水平的光活化。更重要的是，組成上轉換熒光材料的惰 性核心元素和引入的毒性相對較小的稀土鑭系元素 8相對于高毒性金屬，如鎘-硒量子點， 有著獨特的優勢，進而為體內和臨床應用提供了一個安全途徑。
[0004] 目前，光動力療法(PDT)藥物由700nm以下的光譜區域內的UV或可見光激活，該UV 或可見光在組織中的穿透深度有限。常規PDT限于平坦型、淺表腫瘤或用內窺鏡容易接近的 腫瘤，然而實體器官腫瘤的厚度要比當前技術可穿透的深度更大。為了克服使用UV/可見光 的傳統tot的深度的局限性，以及使切除大體積實體腫瘤或深部腫瘤成為可能，可以使用處 于NIR區域(700nm-1100nm)的光實現最大的組織穿透深度。NIR波長的光較少被表皮黑色素 吸收，比短波長光的光散射要少，與可見光比更深地穿入人體皮膚真皮和血液。已被證明， 在這個光譜區域內的光可穿透組織深度超過1厘米，而介入組織未觀察到損害。因此，使用 NIR激活光敏劑的PDT過程在此稱為NIR-PDT，可擴展到治療厚的、大體積的或深部腫瘤，針 對不同大小、類型和位置的腫瘤，提供更廣泛的治療選擇。幾乎所有的目前市場上銷售的 PDT光敏劑只由UV/可見光激活，將NIR光應用到PDT中需要一個光轉換器，所述光轉換器能 將深度穿透、低能量的NIR光轉換為高能量、較短波長的UV/可見光，使得在深度上能與這些 光敏劑的激活吸收光譜相匹配。仍然需要開發一種近紅外光動力學治療藥物，通過提供更 大的NIR光穿透深度，用以克服常規光動力學療法的局限性，并進一步將所述NIR光上轉換 為UV/可見光。尤其是，NIR-PDT藥物能夠生成多種類型活性氧類（reactive oxygen speCieS，ROS)，對新型光動力療法的發展尤其重要，因為這些藥物能使多元化摧毀靶細胞 機制成為可能。
【發明內容】
[0005] 本發明涉及一種由二氧化鈦(Ti02)層包覆的上轉換納米顆粒(UCNhUCN核心作為 納米轉換器，將近紅外光(NIR)轉換為可見和紫外(UV)光，Ti0 2殼作為光催化劑。當只被單 一波長的NIR激發時，UCN將NIR光上轉換為不同波長的UV和可見光。發射出的UV和包覆Ti0 2 的吸收波長的光譜重疊將Ti02層激活，生成細胞毒性活性氧類。
【附圖說明】
[0006] 如附圖所示，根據下述對本發明實施例更具體的描述，前述內容將得以明確。
[0007] 圖1A-D示出包覆Ti〇2的NaYF4:Yb，Tm UCN。圖1A是Ti〇2-UCN的透射電鏡圖（比例尺， 50nm)。圖1B是Ti02-UCN在980nm NIR激光激發下的熒光發射譜圖。插圖示出純Ti02的吸收譜 圖（任意單位，（a. u.))。圖1C示出在980nm NIR輻照下（2.16W/cm2)Ti〇2_UCN的R0S產量，由 R0S熒光標記物-氨基苯基熒光素(APF)測定。繪制出APF熒光與在980nm NIR激光下暴露時 間（t)的關系曲線。數值為平均數土標準差(每組實驗重復進行）。圖1D為Ti02-UCN生成R0S 的機理的示意圖（不按比例）。如圖1B所示，由980nm NIR光激發后，UCN將NIR光上轉化為不 同波長的UV和可見光。UV發射光和包覆Ti02的吸收波長的光譜重疊激活Ti0 2殼，殼電子從價 帶上被激發到導帶上，生成電子空穴對(eT-h+)。形成的空穴將水(H20)分子氧化生成羥基自 由基（· 0H)，同時電子將氧氣(02)還原得到過超氧陰離子（· 0〇或過氧化氫(H2〇2)。
[0008] 圖2A-2C示出Ti〇2-UCN熒光的穩定性。不同生理溶液中NIR輻照Ti〇2-UCN懸浮液的 熒光發射光譜（圖2A)，水中不同時長下NIR輻照Ti0 2-UCN懸浮液的熒光發射光譜（圖2B)，酸 性水中不同持續時間下NIR輻照Ti02-UCN懸浮液的熒光發射光譜（圖2C)。
[0009] 圖3A-3E示出NIR輻照Ti〇2-UCN懸浮液在水中生成的R0S的類型。分別將丙酮酸鈉、 二甲基亞砜(DMS0)、鈦鐵試劑和疊氮化鈉等清除劑加入到980nm NIR激光輻照下（2.16W/ cm2)的Ti02-UCN懸浮液中，通過APF染料的熒光猝滅，檢測生成的過氧化氫（圖3A)、羥基自由 基（圖3B)、超氧離子（圖3C)、單線態氧（圖3D)的存在。繪制出APF熒光與在980nm NIR激光下 暴露時間（t)的關系曲線。數值為平均數±標準差(每組實驗重復進行）。與沒有加入清除劑 的NIR輻照Ti0 2-UCN相比，乍<0.05。圖3E示出使用特定于單線態氧-單線態氧轉換器綠色染 料的熒光標記物對NIR輻照Ti0 2-UCN生成的單線態氧進行驗證研究。繪制出染料熒光與在 980nm NIR激光下暴露時間（t)的關系曲線。
[0010] 圖4表明Ti〇2-UCN以干粉儲存在室溫(RT)下的保質期。在室溫下儲存不同天數的 Ti02-UCN在980nm NIR(2.16W/cm2)下輻照60分鐘生成R0S的活性由APF熒光監測，監測進行2 個月以上。繪制出其活性與儲存天數的關系曲線。
[0011] 圖5示出在不同條件下以干粉儲存20天的Ti〇2-UCN生成R0S的情況。儲存前以及在 黑暗中4 C下儲存20天后、在黑暗中室溫下儲存20天后或在光下室溫下儲存20天后的Ti〇2_ UCN在980nm NIR(2.16W/cm2)下輻照60分鐘生成R0S的活性由APF熒光檢測，繪制出其活性 與儲存天數的關系曲線。
[0012 ]圖6表明T i 02-UCN以干粉儲存在4 °C下的保質期。在4 °C下儲存不同天數的T i 02-UCN 在980nm NIR(2.16W/cm2)下輻照60分鐘生成ROS的活性由APF熒光監測，監測進行2個月以 上。繪制出其活性與儲存天數的關系曲線。數值為平均數±標準差(每組實驗重復進行）。 [0013] 圖7示出以干粉在4°C儲存4天、在-20°C儲存4天的Ti02-UCN生成R0S的對比圖（4°C 與-20°C之間，P>0.05)。在980nm NIR輻照下（2.16W/cm2)Ti〇2_UCN生成ROS的活性由APF熒光 檢測，繪制出其活性與在980nm NIR激光下暴露時間（t)的關系曲線。
[0014] 圖8表明當浸于水中時，Ti〇2-UCN生成R0S的活性的穩定性。浸于水中長達24小時， NIR輻照Ti02-UCN(2.16W/cm2、60分鐘)生成的R0S由APF熒光檢測，繪制出其與在水中浸泡的 時間的關系曲線。數值為平均數±標準差(每組實驗重復進行）。與在水中浸泡〇小時相比/ Ρ<0·05〇
[0015] 圖9A-9C表明當儲存在不同條件下再浸于水中24小時后，Ti02-UCN生成ROS的活性 的穩定性。浸入水中前，980nm NIR-輻照1102-1^(2.161/〇112、60分鐘）生成的1^由熒光檢 測，繪制出其與在980nm NIR激光下暴露時間（t)的關系曲線（圖9A);在黑暗中4°C下儲存、 在黑暗中室溫下儲存或在光下室溫下儲存后浸于水中24小時后，980nm NIR-輻照Ti02-UCN (2.161/〇112、60分鐘）生成的1^由熒光檢測，繪制出其與在9801111^11?激光下暴露時間（〇 的關系曲線（圖9B)。用在每種條件下儲存，浸于水中24小時后的APF熒光（圖9B)除以浸泡之 前APF熒光（圖a)的比例來表示Ti0 2-UCN生成R0S的活性的下降，并作圖。
[0016] 圖10示出當在不同溶劑中浸泡過夜，Ti〇2-UCN生成R0S的活性的穩定性。在浸泡前 以及在乙醇(EtOH)中浸泡過夜、在四氫呋喃(THF)中浸泡過夜、在甲苯中浸泡過夜、在氯仿 中浸泡過夜或在無水二甲基亞砜中浸泡過夜后980nm NIR輻照Ti02-UCN生成的R0S用APF熒 光檢測，并繪制出其與在980nm NIR激光下暴露時間（t)的關系曲線。在R0S實驗前，去除相 應溶劑，將Ti02-UCN再懸浮于水中。數值為平均數±標準差(每組實驗重復進行）。與浸泡前 相比廣P<〇.〇5。
[0017] 圖 11A-11E描述Ti〇2_UCN和Mal-PEG-Ti〇2_UCN的合成示意圖（圖 11A);Ti〇2_UCN的 透射電鏡圖（TEM)(圖11B)(比例尺:50nm) ;Mal-PEG-Ti02-UCN的透射電鏡圖（TEM)(圖11C) (比例尺:50nm);在不同功率密度NIR激發(光電倍增管(PMT)電壓500V)下，在磷酸鹽緩沖液 O^BS)中100yg/mL Ti02-UCN的熒光光譜（圖11D);插圖表明在90W/cm2NIR激發下Ti0 2-UCN的 熒光發射光譜;Ti02-UCN、馬來酰亞胺-聚乙二醇-硅烷和馬來酰亞胺-聚乙二醇-硅烷共輒 Ti02-UCN(Mal-PEG-Ti02_UCN)的傅里葉變換紅外(FT-IR)吸收光譜（圖11E)。
[0018] 圖 12A-12B描述UCN(NaYF4: Yb，Tm)核、包覆二氧化硅的UCN(NaYF4: Yb，Tm@Si〇2)、淬 火前Ti〇2_UCN(包覆Ti〇2的NaYF4: Yb，Tm@Si02)的TEM圖（比例尺：20nm)(圖 12A);與體外 (2.1W/cm2)和體內（0.5W/cm2)TOT(PMT電壓為950V)等量功率密度的NIR激發下PBS中300yg/ mL Ti02-UCN的熒光發射光譜（圖12B)。
[0019] 圖13A-13F描述Ti〇2-UCN和Mal-PEG-Ti02-UCN的特征。圖13A示出在室溫下浸泡于 不同介質中的l〇〇yg/mL Ti02-UCN的平均流體力學尺寸與納米顆粒浸泡時間的關系曲線， 與不含胎牛血清(FBS)的RMPI中Ti〇2_UCN的尺寸相比，*P<0.0001。圖13B示出添加10%FBS 對浸泡于TOS中100yg/mL Ti02-UCN的流體力學尺寸的影響，與浸泡24小時的Ti02-UCN的尺 寸相比，*Ρ<〇.〇〇〇1。圖13C示出室溫下不同溶液中100yg/mL Ma 1 -PEG-Ti02-UCN的平均流體 力學尺寸與時間的關系曲線。圖13D示出銀染凝膠圖像，以檢測懸浮于含10 % FBS的RPMI或 含100 % FBS的RPMI中納米顆粒表面血清蛋白的吸附。水中未改性Ti02-UCN和100 % FBS中未 改性Ti02-UCN分別作為陰性對照和陽性對照。圖13E為PBS中被輻照納米顆粒和未被輻照納 米顆粒生成ROS的對比圖，60分鐘后，與未輻照Ti02-UCN和未輻照Mal-PEG_Ti02-UCN生成的 ROS相比，*，％〈0.0001。數據值為平均值(11>2)±標準差。圖13?為當不同厚度組織模擬樣品 存在時，由NIR、UV輻照的lmg/mL Mal-PEG-Ti〇2_UCN生成ROS的對比圖，與ROS相比，*P< 0.05〇
[0020] 圖14A-14F描述Ti〇2-UCN和Mal-PEG-Ti〇2-UCN的特征，例如，在室溫下浸泡于不同 介質中的100yg/mL Ti02-UCN的平均多分散性指數(PDI)與納米顆粒浸泡時間的關系曲線 (圖14A)。圖14B表示添加10%FBS對浸泡于PBS中100yg/mL Ti〇2_UCN的PDI的影響。圖14C示 出在37°C下浸泡于不同生理溶液的Ti02-UCN的平均流體力學尺寸與時間的關系曲線，所述 平均流體力學尺寸用動力光散射進行長達24小時的監測。數據值為平均值(n>2)±標準 差。圖14D示出在PBS中浸泡6小時的100yg/mL Ti〇2_UCN、在PBS中浸泡24小時的100yg/mL Ti〇2_UCN以及在含10%血清的PBS中浸泡24小時（圖14E)的100yg/mL Ti〇2_UCN的團聚體形 成的不同。在室溫下不同溶液中1 〇〇yg/mL Ma 1 -PEG-Ti02-UCN的平均TOI與時間的關系曲線 圖（圖14E)。在roS中浸泡0小時、6小時、24小時的100yg/mL Mal-PEG-Ti〇2_UCN的穩定分散 體的圖像(圖14F)。
[0021] 圖15A-15F描述本發明中Ti〇2-UCN的體外攝取。圖15A示出上轉換熒光的代表性熒 光顯微鏡圖像(列3)，其表明用ImM相應的納米顆粒培養巨噬細胞1小時后，巨噬細胞對納米 顆粒的攝取;列1和列2分別表示細胞膜和細胞核的熒光(比例尺:50μπι)。圖15B示出在1小時 培養中，巨噬細胞攝取的所述ImM納米顆粒的熒光強度的對比圖，乍=0.0004。數據是平均 熒光強度(n>3)±標準差。圖15C示出，當口腔鱗狀細胞癌(0SCC)細胞攝取ImM Ti02-UCN或 Mal-PEG_Ti02-UCN后，由ICP-AES分析得到的鈦含量的對比圖，*P<0.0001。數據是鈦的平均 濃度（N=2) 土標準差。圖15D為由0SCC細胞培養的經甲氧基-聚乙二醇-硅烷(Met-PEG-TiOrUCN)或馬來酰亞胺-聚乙二醇-硅烷(Mal-PEG_Ti0 2-UCN)表面改性的ImM Ti02-UCN的 熒光強度的對比圖，*P<〇.〇5。數據是平均熒光強度(n>3) 土標準差。圖15E示出相對UCN熒 光強度，其表明N-乙基馬來酰亞胺(NEM)對Mal-PEG_Ti02-UCN的細胞攝取的影響，0SCC細胞 在含有或不含有InM NEM的無血清RPMI中預培養15分鐘，用ImM Mal-PEG-Ti〇2_UCN培養6小 時(數據是平均值(η<6) 土標準差，*P = 0.0464)。圖15F示出培養3小時后，血清蛋白對0SCC 細胞中ImM Mal-PEG_Ti02-UCN的結合和內化的影響，*P = 0.0091。數據是平均熒光強度(n> 3) 土標準差。
[0022] 圖16A-16D描述由MTT法檢測到的由0SCC細胞培養6小時后的納米顆粒的暗毒性/ P = 0.0082(圖16A)。圖16B示出由MTT法檢測到的由正常人成纖維(NHF)細胞培養的納米顆 粒的暗毒性，數據是平均值(n = 3) 土標準差。圖16C示出由臺盼藍染色法檢測到的由0SCC細 胞培養的納米顆粒的暗毒性，數據是平均值(n = 3)±標準差。圖16C和16D示出用濃度增加 的納米顆粒培養2小時中，人類紅細胞(RBC)的溶血率/P〈0.05廣P〈0.0001，數據值為平均 值土標準差，n = 4。
[0023] 圖17為對用于體外TOT的NIR激光劑量進行優化的條形圖。用變化的功率和能量密 度的980nm NIR激光對經ImM Mal-PEG_Ti02-UCN處理的0SCC細胞進行輻照。光對照同時進 行:用相同的功率和光能量密度對未經過任何納米顆粒處理的細胞進行輻照。細胞對Η)Τ治 療的反應通過測量其活性進行量化。NIR激光功率1.2W、光能量密度設為675J/cm 2、提供最 低細胞活性且忽略僅由NIR光引起的細胞死亡ΓΡ<0.0001)，選為用于所有后續PDT研究的 最佳NIR激光劑量。數據為平均值(n>3) ±標準差。
[0024] 圖18A-18C為Ti〇2_UCN和Mal-PEG-Ti〇2_UCN的對比圖。圖18A示出在納米顆粒存在 的情況下進行體外PDT后的24小時后，0SCC細胞活性;對照細胞為未處理細胞，假定其細胞 活性100%，光對照為僅由NIR光處理的細胞。數據為平均細胞活性％(11 = 3) 土標準差。圖 18B示出基于羧基DCF的熒光強度，對R0S生成程度進行量化(數據為平均相對熒光強度(η = 3) 土標準差）。圖18C示出亮場下活細胞圖像，用臺盼藍對比染色表明0SCC細胞的細胞死亡 機制，插圖示出正凋亡細胞(比例尺:1 〇μπι)。
[0025] 圖19A-19C描述細胞攝取、細胞活性和ImM Mal-PEG_Ti02-UCN的體外R0S生成能力 的變化，所述Mal-PEG_Ti02-UCN由0SCC細胞培養1小時或6小時。圖19A示出上轉換熒光的熒 光顯微鏡圖像，用以表明Mal-PEG-Ti0 2-UCN的存在。當Mal-PEG-Ti02-UCN用0SCC細胞培養較 短時間（1小時），它們主要位于細胞膜中（箭頭）（比例尺:20μπι)。圖19B示出ImM Mal-PEG-Ti02-UCN在培養1小時、6小時后進行675J/cm2NIR-PDT后細胞活性的對比圖，*P<0.5(數據 是平均值(n = 3) 土標準差）。圖19C示出當培養1小時和6小時的ImM Mal-PEG-Ti〇2_UCN存在 時，進行Η)Τ后，體外R0S生成的對比圖。示出綠色熒光的圖像(比例尺:25μπι)表明R0S熒光標 記物-羧基DCF的陽性染色。
【具體實施方式】
[0026] 本發明的實施例如下。
[0027] "納米復合材料"指的是與第二種材料結合的納米顆粒，所述材料對該納米顆粒， 例如，其功能、活性或結構進行改性。例如，第二種材料使得該納米顆粒能應用到特定的應 用中，其中如果不存在第二種材料，該納米材料不能使用。在某些實施例中，第二種材料包 覆在納米顆粒上。在另一些實施例中，納米復合材料的尺寸為約30nm-約200nm。在本發明的 具體實施例中，納米復合材料是包覆有中間包覆層，再依次包覆有半導體材料層的納米顆 粒。連接分子，例如，3-氨丙基三甲氧基硅烷，可選擇地位于中間包覆層上，半導體層下面。
[0028] 在此使用的術語"上轉換"指的是一種將低能量長波長(例如，近紅外光)轉換為高 能量短波長的光(例如，可見光或UV光）。
[0029] "近紅外光"指的是波長為700nm-l 100nm的光。"可見光"指的是波長為400nm-700nm的光。"紫外光"指的是波長為100nm-400nm的光。
[0030]在此使用的"半導體"是一種電導率介于金屬和絕緣體間的材料。半導體的電子帶 結構由低能量"價帶"組成，價帶部分充滿電子，通過一條帶隙與高能量"導帶"分離。
[0031] 在此使用的"活性氧類"包括過氧化氫、羥基自由基、超氧陰離子、單線態氧、一氧 化氮、過氧自由基、過氧化亞硝基陰離子。
[0032] 在此使用的"連接基團"是一種用于連接兩個或多個基團的原子或小分子。在一個 實施例中，連接基團通過一系列的共價鍵將靶向劑和由半導體材料層包覆的上轉換納米顆 粒(UCN)相連。由半導體材料層包覆的上轉換納米顆粒(UCN)可互換地稱之為在此所述的納 米復合材料。連接基團與半導體包覆層表面相連。在某些實施例中，連接基團是聚乙二醇。
[0033] 在一個可選擇的實施例中，連接基團用以將UCN與包覆層相連。例如，連接基團是 (3-氨丙基)_三甲氧基硅烷(APS)。在可選的實施例中，中間包覆層是硅基組合物，所述硅基 組合物包括Si〇2和部分水解二氧化硅，例如H2Si〇3、H4Si〇4、H2Si2〇 5、H6Si2(^PSiH4〇4。
[0034] 一連接基團，例如，聚乙二醇，賦予包覆半導體的UCN-些優點，例如，提高納米復 合材料在水環境中的分散性，提高納米復合材料在循環中的壽命使得其到達靶向腫瘤部位 的機會更大。在某些實施例中，連接分子，例如APS，使得上轉換顆粒的表面或包覆層(例如 中間Si0 2包覆層)表面帶正電荷。顆粒表面帶電荷的優勢在于，由于相似帶電顆粒間的互斥 作用，可防止顆粒與其他顆粒間團聚。因此，這些帶電顆粒在溶液中實現單分散性。單分散 性使得半導體材料包覆單個納米顆粒，而不是包覆一堆納米顆粒團聚體導致形成包覆半導 體的UCN團聚塊體。在另一些實施例中，納米顆粒表面的正電荷使得Si0 2包覆UCN的表面包 覆層上的Ti02前驅體發生水解，因此在每個納米顆粒的表面包覆有均勻一致的Ti0 2殼層。在 一些實施例中，水解步驟中，二氧化硅中間層部分水解，形成包含Si02以及H 2Si03的層。相應 的，在一實施例中，連接基團可以是分散穩定劑。術語"分散穩定劑"指的是包含疏水端和親 水端的物質，當與納米顆粒相關聯時，可阻止納米顆粒在溶液中團聚。分散穩定劑的一個實 例是聚乙二醇(PEG)。
[0035] 在此使用的"靶向劑"指的是在體外或體內應用中，對生物靶有親和力的結構。生 物靶包括細胞表面受體。在另一些實施例中，生物靶可以是抗原、蛋白或肽。
[0036] 在此使用的"抗體"是一種識別和中和如細菌或病毒等異物的蛋白質。抗體可以是 多克隆或單克隆，術語"抗體"旨在包括多克隆和單克隆抗體。術語"多克隆"和"單克隆"指 的是抗體制備的均一化程度，但并不限定于特定的生產方法。此處使用的術語"抗體"還包 括抗體的功能片段，例如，嵌合、人源化、靈長類、全或單鏈抗體的片段。功能片段包括抗原_ 結合片段。這些片段可以通過酶裂解或重組技術制備。例如，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或具有 必要底物特異性的其他蛋白酶也可用于生成片段。使用抗體基因，在其自然終止點的上游 引入一個或多個終止密碼子，也可以制備多種截斷形式的抗體。
[0037] 在此使用的"親和體"是一種作為抗體模擬物的小型蛋白質。在某些實施例中，親 和體對特定大蛋白質或肽有結合親和力。
[0038] 術語"適配體"同時包括低聚核酸適配體和肽核酸適配體。在某些實施例中，適配 體對小分子、蛋白質、核酸、細胞、組織和有機體有結合親和力。在另一些實施例中，適配體 干擾生物過程，例如細胞內蛋白質的相互作用。
[0039] 術語"治療"（treat,treatment,treat ing)是指抑制正要治療的疾病或病癥的進 程或防止所述疾病或病癥。此處使用的治療可以指大量靶的減少。在一個實施例中，靶或生 物革El是癌細胞，且治療可減少癌細胞數量。
[0040] 符號"NP0C"，例如NaYF4@Ti〇2，在本申請中代表一種納米顆粒，例如，含有如Ti〇2包 覆層的半導體包覆層的NaYF4。
[0041] 本發明涉及由連續二氧化鈦(Ti02)層包覆的均勻上轉換納米顆粒(UCN)的應用， 其作為光轉換器，將深度穿透、安全、低能量近紅外(NIR)光轉換為較高能量、較短波長的可 見光和紫外光(UV)，這些光的波長與包覆Ti0 2的激活吸收光譜相匹配以生成具有不同應用 的活性氧類(R0S)，例如，光動力療法(PDT)、廢水處理、家庭和醫院表面殺菌除臭、親水表面 發展為自清潔和防霧涂層、多肽和蛋白質裂解。包覆半導體材料的上轉換納米顆粒在協同 無創成像和深部大腫瘤的光動力治療中有用。在光動力療法中使用NIR光，通過提供具有更 大穿透深度的NIR光和上轉化納米顆粒，將NIR轉換為UV/可見光，以幫助克服常規TOT的局 限性。
[0042]上轉換納米材料，如，共摻雜鑭系離子Yb和TM的NaYF4納米晶體，形成納米構建物 的核，同時Ti〇2層包覆在核表面形成最終核殼結構Ti〇2-UCN(圖1A)。在此，UCN核作為納米轉 換器，將深度穿透NIR光轉換為可見光和UV光，而Ti0 2殼作為光催化劑。當僅由單一 980nm波 長的光激發，UCN可將NIR光上轉換為不同波長的UV和可見光（圖lBhUV發射光和包覆Ti02 9 (圖1B插圖）的吸收波長的光譜重疊將Ti02層激活，生成幾種包括羥基自由基、超氧陰離子 和過氧化氫的細胞毒性活性氧類(R0S)(圖1C)，R0S可用于TOT中殺死癌細胞，或用于家庭和 醫院表面殺菌除臭中殺死微生物；用于廢水治理中分解有機污染物；以及裂解肽和蛋白質 (圖1D)。當懸浮于不同生理溶液中，如水、PBS、含有或不含血清補充的DMEM培養基，在980nm NIR激發下，這些Ti0 2-UCN的熒光的穩定性的研究表明，它們的熒光發射強度無明顯差異 (圖2A)。有趣的是，當在pH為4的酸性水體中浸泡長達3.5小時，這些顆粒的光穩定性特征仍 可以觀察到（圖2C)，盡管與在水中（pH約6.5)浸泡相同時間相比，熒光強度略有下降（圖 2B)。在后續下游生物學應用中，這些顆粒被細胞，如內含體或溶酶體吞入其酸性結構中，上 述研究發現對此會存在有用的啟示。
[0043] 如前述附圖1C所示，在NIR輻照下，Ti02-UCN成功地生成了 R0S。在此，染料氨基苯 基熒光素(APF)用作R0S指示物。染料APF-直無熒光直至當它與R0S分子反應時被氧化，發 出明亮的綠色熒光。將不同含量Ti0 2-UCN在980nm下每隔20分鐘進行輻照，測量染料APF在 水中的熒光發射，可以看出隨著被輻照Ti0 2-UCN含量的增加，染料APF熒光強度有明顯的相 應增加（圖1C)。為了確定懸浮于水中的NIR-輻照Ti0 2-UCN生成的R0S的類型，進行一系列的 清除劑實驗。
[0044] 分別將過氧化氫、羥基自由基、超氧陰離子和單線態氧各自的清除劑:丙酮酸鈉、 DMS0、鈦鐵試劑和疊氮化鈉加入到980nm NIR激光輻照下的Ti02-UCN懸浮液中。加入這些相 應清除劑后，APF染料的熒光猝滅證明某一特定類型R0S的存在。如圖3A-3C所示，觀察到含 有清除劑丙酮酸鈉、DMS0和鈦鐵試劑的樣品的熒光猝滅（與未添加清除劑的輻照Ti0 2-UCN 相比，P分別是0.02328、0.00766和0.00317)，而含有清除劑疊氮化鈉的樣品未表現出APF染 料的淬滅（圖3D)。這表明，光致Ti0 2-UCN生成一種以上的活性氧類(R0S)，包括過氧化氫、羥 基自由基和超氧陰離子。雖然結果表明未生成單線態氧，但加入清除劑疊氮化鈉，觀察到 APF染料熒光增強是相當令人吃驚的。為了避免可能的混雜結果，該研究由另一個實驗只使 用特異于單線態氧的熒光標記-單線態氧轉換器綠色染料進行驗證。該實驗未檢測到NIR-輻照Ti0 2-UCN懸浮液中單線態氧轉換器綠色染料的熒光增加（圖3E)，從而驗證了清除劑實 驗結果，即NIR-輻照Ti0 2-UCN未生成單線態氧。事實上，這與常規PDT形成對比，常規PDT利 用由直射可見光激活光敏劑生成的單線態氧殺死癌細胞。這可能對Ti0 2-UCN-介導PDT殺死 細胞的機制有所啟示且該機制可能與常規roT不同。
[0045] 因為儲存條件可能對Ti02-UCN生成R0S的活性有影響，這部分用于研究Ti02-UCN保 質期。當Ti0 2-UCN以干粉形式在室溫(RT)下沉化2個多月期間，對其在980nm NIR輻照下生 成R0S的活性進行監測。在該儲存條件下，可以清楚地觀察到Ti02-UCN生成R0S的活性隨著 時間下降（圖4)。根據這一觀察，試圖尋找一個最佳的儲存條件使得Ti0 2-UCN生成R0S的活 性得到最好地保持。設計一個簡短的實驗，其中納米顆粒以干粉形式在不同條件下一黑暗 中4°C、黑暗中室溫或光下室溫下儲存20天，（圖ShTiOs-UCN在黑暗中4°C下的沉化與其生 成ROS的活性的明顯降低并不相關。事實上，這與下述形成鮮明的對比，當上述納米顆粒在 室溫下黑暗或光照下儲存同樣時間，其生成R0S的活性似乎會大大降低。現已確定能最好地 保持Ti02-UCN生成R0S的活性的最佳條件，然后對在該條件下儲存的納米顆粒的保質期進 行大約2個月的監測。盡管在儲存前10天，Ti0 2-UCN生成R0S的活性下降不少，在接下來長達 57天的儲存期內，其活性水平變穩定。在這里值得注意的是，儲存0天時與儲存57天時的納 米顆粒生成R0S的活性水平沒有明顯不同（儲存0天與儲存57天，P = 0.10247)(圖6)。通過將 納米顆粒以干粉在_20°C下儲存4天，進一步地試圖研究較低溫度對Ti02-UCN生成R0S的活 性是否有影響。與在4°C下儲存相同時間的納米顆粒相比，并未觀察到Ti0 2-UCN生成R0S的 活性存在明顯的差異(儲存在4°C與-20°C之間，P = 0.4211)(圖7)。因此看來，將Ti02-UCN粉 末儲存在冰箱里足以保持其保質期，從這個意義上看，更低的冰箱溫度未必更好。
[0046]這些納米顆粒隨后用作活細胞和有機體的PDT試劑，所述PDT試劑主要含有水溶 液，測定這些在水中長時間浸泡的納米顆粒生成R0S的穩定性。在此，將T i 02-UCN在室溫下 在水中浸泡達24小時，在此期間測定不同時間點處生成R0S的活性。從圖8中可以明顯看出， Ti02-UCN與水接觸，其生成R0S的活性逐漸下降，但僅當浸泡24小時時存在顯著性差異（與 在水中浸泡0小時對比，24小時時P = 0.04225)。為了延緩與水接觸時，Ti02-UCN生成R0S的 活性逐漸喪失，嘗試使用將其儲存在不同條件下的方法。將在不同條件下-黑暗中4°C、黑暗 中室溫下或光下室溫下沉化20天(來自圖5所示的之前的研究，在這部分又重新使用，見圖 9A)的Ti0 2-UCN粉末浸于水中，懸浮液分別在黑暗中4°C、黑暗中室溫下或光下室溫中保存 24小時。在這些不同的條件下儲存24小時后，測定它們生成R0S的活性（圖9B)。從圖9C中可 以明顯看出，當這些納米顆粒的懸浮液儲存在黑暗中4°C時，浸于水中的Ti0 2-UCN生成R0S 活性的喪失延緩，R0S的生成量僅降低至77.3%，而與此相對比，當儲存在黑暗中室溫下或 光下室溫中時，R0S生成量降低到相當的水平，分別為46.8%和48.1 %。因此，為保持生成 R0S的活性，最好將水溶液中的Ti02-UCN懸浮液保持冰冷，等待給細胞/動物使用。
[0047]認識到當Ti02-UCN與水接觸時，會慢慢失去生成R0S的活性，尋找能更好保存Ti02-UCN生成R0S的活性的溶劑變得重要。基于這樣的基本原理，在后面的研究部分中，隨后使用 聚乙二醇(PEG)和癌癥特異性靶向劑(這將有助于分別提高其生物相容性和靶向性)等分子 對這些納米顆粒進行表面改性。通常，這些表面改性步驟需要這些納米顆粒與一定的溶劑 長時間接觸才能發生接枝/共輒。為了研究哪種溶劑能最好地保存Ti0 2-UCN生成R0S的活 性，將這些納米顆粒在乙醇(EtOH)、四氫呋喃(THF)、甲苯、氯仿或無水DMS0不同溶劑中浸泡 過夜。對它們在不同溶劑中浸泡前后生成R0S的穩定性進行對比。將納米顆粒浸泡在甲苯、 氯仿或無水DMS0中時，它們生成R0S的活性大幅下降（與浸泡前相比，P分別為0.01015、 0.00711和0.00746)，而在EtOH或THF中浸泡對這些納米顆粒似乎不存在這樣的影響（圖 10)。事實上，與浸泡之前的R0S生成量相比，無論是在EtOH還是THF中浸泡的納米顆粒的R0S 生成量似乎幾乎不變(與浸泡前相比，P分別為〇. 97243和0.85389)。因此，EtOH或THF是用于 后續表面改性步驟最適合的溶劑。
[0048]與現有UCN基PDT藥物不同，Ti02包覆在UCN核上形成所定義的核殼結構，其中Ti02 層直接用作光敏劑藥物。與現有UCN基PDT藥物相比，本發明中復合材料和治療組合物是更 好的光動力療法試劑。具體來說，之前報道的Ti0 2-UCN納米復合材料^12大小不一、分散不 均、形狀不規則。另外，之前報道的顆粒 12在微米范圍內，因此，應正確歸類為微晶。在生物應 用中，這樣的結構沒有納米顆粒那么有用，因為它們不容易被體內細胞攝取。在一些研究11 中，Ti02半導體成分配置為僅圍繞UCN核的納米顆粒而沒有形成UCN核上的連續的Ti02層，進 而沒有形成在本發明中明確定義的核殼結構。此外，因為光敏劑Ti0 2直接包覆在UCN表面形 成核殼結構，該復合材料并不存在光敏劑分子浸出的問題。這與包覆光敏劑負載介孔二氧 化硅的UCN~ 15形成對比，其中光敏劑分子只是吸附在二氧化硅殼的孔隙上。還有，光致Ti02 生成一種以上的活性氧類(ROS)，包括羥基自由基、超氧陰離子和過氧化氫。這種多樣性與 僅生成單線態氧分子的常規光敏劑分子，如二氫卟吩e6和部花青540形成對比。因此，使用 本發明中的復合材料用作光動力療法的試劑，使多元化摧毀靶細胞機制成為可能，從而該 材料比常規光敏劑分子更有效。
[0049] 本發明中的復合材料有廣泛的可能應用。例如，該材料可作為用于大范圍的大小、 類型和位置的腫瘤的光動力療法的組合物。因為具有克服常規TOT穿透深度局限性的潛力， 使用Ti0 2-UCN的NIR-PDT能用于厚的、大體積的或深部腫瘤的治療，從而使得PDT成為更大 范圍的大小、類型和位置的腫瘤的治療選擇。通過使用安全NIR光激發而不是由有害UV光直 接激發對有機污染物進行光氧化活化，Ti0 2-UCN材料也可以作為廢水治理的解毒劑用于環 境凈化。Ti02-UCN材料在安全NIR光激發(而不是由有害UV光直接激發)下釋放R0S因而具有 抗菌活性，可用于家庭和醫院表面殺菌除臭。在另一應用中，玻璃表面可包覆有Ti0 2-UCN， 經在安全NIR光激發下形成的上轉換UV和可見光活化形成疏水表面。這可以用于形成自清 潔玻璃和防霧涂層。在另一個實施例中，NIR光活化的Ti0 2-UCN在溶液或懸浮液中生成的自 由基可用于清除脯氨酸存在位點處的含有氨基酸脯氨酸的蛋白質。現有方法需要蛋白水解 酶或化學試劑，通常還需要用于終止裂解的第二試劑，與此相對比，這可能為研究人員具有 一個高度可調的蛋白質裂解過程提供一種輕便、低廉、快速的替代方法。
[0050] 用聚乙二醇(PEG)對核殼Ti〇2-UCN表面改性使其具有穩定性和隱形性能，更有利 于生物應用，并因此防止納米顆粒的細胞殺傷能力飽和。具體地說，在體內和體外，將這些 改性Ti0 2-UCN暴露在NIR下，使得用戶可使用本發明所述的納米顆粒治療實體腫瘤。
[0051 ]相應地，在一個實施例中，本發明是一種用于光動力療法的納米復合材料，包括： 上轉換納米顆粒，所述納米顆粒在近紅外光激發下，發射出波長約330nm-675nm的光；和所 述納米顆粒外表面上的連續均勻的外包覆層，所述包覆層包括半導體材料，其中所述納米 顆粒的發射光具有足以將一個或多個電子從半導體材料的價帶激發到半導體材料的導帶 上的波長，并生成至少一種活性氧類(R0S)。
[0052] 在另一實施例中，所述納米顆粒包含摻雜約lOmol%-約30mol%Yb3 +和約 0.3mo 1 / % -約 2mo 1 / % Tm3+的 NaYF4納米晶體。
[0053] 在另一實施例中，Y:Yb:Tm摩爾比是79.5:20:0.5。
[0054] 在另一實施例中，半導體材料是Ti02。
[0055]在另一實施例中，所述納米復合材料還包括含有二氧化硅基組合物的中間包覆 層，其中所述中間包覆層位于上轉換納米顆粒和包括半導體材料的外包覆層之間。
[0056]在另一實施例中，所述中間包覆層還含有3-氨丙基三甲氧基硅烷。
[0057]在另一實施例中，所述納米復合材料用靶向劑改性。
[0058]在另一實施例中，所述靶向劑通過連接基團與所述半導體表面連接。
[0059]在另一實施例中，所述連接基團是聚乙二醇。
[0060]在另一實施例中，所述革El向劑是親和體、抗體、適配體、肽或葉酸。
[0061] 在另一實施例中，本發明是一種用于光動力學療法的組合物，包括:與包含納米復 合材料的支架相連的革G向劑，其中所述納米復合材料包括:上轉換納米顆粒，其中所述納米 顆粒在近紅外光激發下，發射出波長約330nm-約675nm的光;和所述納米顆粒外表面上的連 續的包覆層，所述包覆層包括半導體材料，其中所述納米顆粒的發射的光具有足以將一個 或多個電子從半導體材料的價帶激發到半導體材料的導帶上的波長，而且，激發后，半導體 材料的能量足夠以生成至少一種活性氧類。
[0062] 在另一實施例中，革E1向劑可選擇地通過連接基團與所述半導體表面連接。
[0063] 在另一實施例中，本發明是一種生成活性氧類的方法，包括:用近紅外光照射包含 上述實施例中任何一項所述的納米復合材料的樣品和一種或多種選自水或氧的氧源一段 時間，足以將一個或多個電子從半導體材料的價帶激發到半導體材料的導帶上，其中所述 一種或多種氧源發生氧化還原反應，形成活性氧類。
[0064] 在另一實施例中，本發明是一種納米復合材料組合物，包括:多個如上述實施例中 任一項所述的納米復合材料，其中所述納米復合材料均勻地分布在所述組合物中，而且進 一步地，其中所述納米復合材料的形狀和大小均一。
[0065] 在另一實施例中，所述連接基團是一種分散穩定劑。
[0066]在另一實施例中，所述分散穩定劑是PEG。
[0067] 在另一實施例中，所述分散穩定劑的分子量是2000Da或更高。
[0068] 在另一實施例中，本發明是一種使用光動力學療法治療對象體內生物靶的方法， 包括:給對象施用治療有效量的如上述實施例中任一項所述的納米復合材料;將所述納米 復合材料暴露在近紅外光中足以使所述納米復合材料顆粒發射出波長約330nm-約675nm的 光，這樣，生成的至少一種活性氧類治療生物靶。在一個實施例中，足以將一個或多個電子 從半導體材料的價帶激發到半導體材料的導帶上的波長是980nm。
[0069] 在另一實施例中，所述生物靶是癌細胞中過度表達的細胞表面受體。
[0070] 在另一實施例中，所述過度表達的細胞表面受體是表皮生長因子受體。
[0071 ]在另一實施例中，癌細胞是任何來源的異常增殖細胞。
[0072] 在另一實施例中，癌細胞是一種口腔鱗狀細胞。
[0073] Ti02-UCN的構建和研究
[0074] 加入正硅酸乙酯（TE0S)使Ti02殼上的羥基(0H)基團與馬來酰亞胺-聚乙二醇-硅 烷上的硅烷基團相連，形成Ma 1-PEG-T i 02-UCN。T i 02-UCN和Ma 1-PEG-T i 02-UCN的透射電子顯 微鏡（TEM)顯示：具有輪廓清楚的核殼結構的均勻球形，平均初級粒子尺寸約為50nm(圖 ΙΙΒ-ChUCN核的平均直徑約為25nm，UCN核由組合厚度為約12.5nm的二氧化硅層和Ti02殼 包圍（圖12A)。在980nm近紅外光線的輻照下，Ti0 2-UCN發射出UV、可見光和NIR光譜區域內 的上轉換光（圖11D和圖12BKUCN的藍光發射（圖11D和圖12B中450nm和475nm處的峰）可用 于追蹤細胞對納米顆粒的攝取，而對于體內成像，在NIR區域(800nm)的發射可用于捕捉來 自較深組織的信號。傅里葉變換紅外(FT-IR)吸收光譜證實馬來酰亞胺-聚乙二醇-硅烷在 Ti〇2_UCN表面的成功接枝，PEG在約2885cm-1處的特征峰對應C-H伸縮，在約1470-1350(^ 1處 的特征峰對應C-H彎曲（圖11E)。
[0075] 利用Ti02-UCN的初步研究顯示在室溫(RT)下，水中和不同生理溶液中有大的團聚 體(微米范圍內）形成（圖13A和圖14A-B)。而眾所周知的的是，分散在液體中的納米顆粒的 流體動力學尺寸通常比由TEM測得的初級粒子尺寸要大，它們大體上隨著時間和溫度的變 化而增加（圖14C)，導致團聚體的快速沉積。然而，Ti0 2-UCN在含有10 %胎牛血清(FBS)的 RPMI-1640培養基(RPMI)中形成穩定分散體。與在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)和含有10%FBS的 PBS中的團聚特性相對比，發現當缺少FBS時，顆粒尺寸增加超10倍(圖13B和圖14D)。
[0076] 表 1
[0077]
[0078] 在不同溶液中分散后，l〇〇yg/mL Ti〇2_UCN和Mal-PEG-Ti〇2_UCN的即時Zeta電位和 多分散性指數(PDI)。
[0079] 通過測定Zeta-電位研究這些納米顆粒的表面電荷。當Ti〇2納米顆粒分散在水中 時，納米顆粒的表面通常覆蓋羥基基團（TiIV+H20-TiIV-OH+H +)，帶上一個負電荷。盡管 Ti02-UCN有負Zeta電位，其數值大于-30mV(表1)。通常，需要Zeta電位大于+30mV或小于-30mV，才能提供足夠的排斥力來抵消引起顆粒團聚的范德華力的吸引力。據推測，低Zeta電 位(范圍_25.5±6.8)可能是水中Ti0 2-UCN流體動力學尺寸增加的原因。在另一方面，在高 離子強度的分散介質（如PBS和RPMI)中，納米顆粒的流體動力學尺寸受Zeta電位和雙電層 厚度的影響。眾所周知的是，當分散在高離子強度的溶液中時 17,這些納米顆粒周圍的雙電 層厚度變小，相應地，出現一個導致大尺寸團聚體的較弱靜電互斥力。值得注意的是，Ti〇2_ UCN在PBS中的Zeta電位范圍是-24.0 ± 2.3，在不含有FBS的RPMI中的是9.6 ± 1.3。
[0080]因此，弱Zeta電位和更小的雙電層厚度都可能導致在ros和RPMI中形成大的團聚 體。發現將血清蛋白與Ti02-UCN表面結合形成"蛋白暈"，有助于保持分散穩定性18。110 2-UCN表面蛋白質的存在形成一個物理空間屏障，防止納米顆粒的相互接近19。盡管與血清蛋 白的結合可能似乎暫時解決團聚問題，但意味著蛋白暈中某些成分會作為調理素 2()'21。最 終，調理素會引起單核巨噬細胞系統的巨噬細胞識別和去除循環中的納米顆粒，使得納米 顆粒在體內應用的生物有效性降低。因此，需要對Ti0 2-UCN表面改性，提高其分散穩定性， 同時避免調理素的附著。聚乙二醇化構成最有效、最廣泛使用的抗調理素化和空間穩定化 策略 22。通常，需要分子量為2000Da或更大分子量的PEG鏈以實現隱形特征23,這樣，才能保 持對吞噬細胞不可見。
[0081 ] 因此，使用分子量2000Da的馬來酰亞胺-聚乙二醇-硅烷對Ti〇2-UCN進行表面改 性。馬來酰亞胺基團作為反應性基團用于與腫瘤靶部分的進一步結合，用于之后納米顆粒 的靶向傳輸。據知，納米顆粒的聚乙二醇化降低表面能，最小化納米顆粒間相互吸引的范德 華力，通過增加顆粒間的空間距離形成納米顆粒穩定分散體 24。即使在缺少FBS時，Ti02-UCN 的聚乙二醇化獲得長達24小時的分散穩定性，具有更小的流體動力學尺寸（~300nm)(圖 13C和圖14E-F)。因為聚乙二醇化進一步降低Ti02-UCN的負Zeta電位（表1)，在Mal-PEG-Ti0 2-UCN情況下觀察到的分散穩定性不是由于靜電排斥作用而是由于PEG鏈間的空間排斥 作用來得以保證的。此外，在不同溶液，除了含有10%FBS的RPMI中的Ti02-UCN的多分散指 數(PDI)稍大于0.2，Mal-PEG_Ti0 2-UCN的多分散性指數是小于0.2的，再一次表明穩定分散 體的形成(表1)。
[0082] 通過將納米顆粒浸泡于含有10%FBS的RPMI和含有100%FBS的RPMI中，然后離心 分離粘附有血清蛋白的納米顆粒，來研究聚乙二醇化降低蛋白質吸附的能力。凝膠電泳和 銀染顯示，聚乙二醇化顯著降低血清蛋白在Ti0 2-UCN表面上的吸附（圖13D)。與未輻照納米 顆粒相比，在NIR輻照下，PBS中的Ti02-UCN和Mal-PEG_Ti0 2-UCN都可以生成大量的R0S(圖 13E)。除此之外，利用不同厚度(范圍的組織模擬體，使用上轉換UV光間接激發 Ti02后，測定NIR光的組織穿透能力和其R0S生成能力，進一步地將此與使用UV光直接激發 Ti02的情況相比（圖13F)。研究發現，在10mm厚的組織模擬體中，由NIR光輻照生成的R0S只 下降36%，由UV光輻照生成的R0S下降超過90%。因此，與使用群光直接激發110 2殼相比，使 用NIR光間接激發的優點是穿透厚的組織，可進一步突出該納米構建物在實體或深部腫瘤 治療中的適用性。
[0083]巨噬細胞和癌細胞中納米顆粒的攝取
[0084]聚乙二醇的存在也降低了小鼠巨噬細胞對納米顆粒的識別和攝取。培養巨噬細胞 1小時后，攝取的Ti〇2-UCN比攝取的Mal-PEG-Ti〇2-UCN多了近4倍（圖15A-B)。
[0085] Ti02-UCN和Mal-PEG_Ti02-UCN與人體口腔鱗狀細胞癌(0SCC)共培養不同時間點， 洗滌除去非結合的納米顆粒。隨后，細胞被消化，使用電感耦合等離子體原子發射光譜 (ICP-AES)定量分析消化液中的鈦含量。結果發現，雖然聚乙二醇化減少巨噬細胞對納米顆 粒的攝取，但與Ti0 2-UCN相對比，0SCC細胞對納米顆粒的攝取顯著增強（圖15C)。而且，與培 養3小時相比，培養6小時后的攝取更為顯著。6小時培養結束時，在細胞質中觀察到大部分 納米顆粒。然而，與6小時時間點相比，培養24小時后的鈦含量下降。此后，一些被攝入的納 米顆粒在24小時內通過胞吐排出去 25'26。
[0086]經常有爭論認為，雖然聚乙二醇化減少巨噬細胞的識別和攝取，它可能反過來減 少細胞攝取，降低如納米傳輸系統的治療潛力。然而，觀察到癌細胞攝取的Mal-PEG_Ti02-UCN相比Ti0 2-UCN要多。因為馬來酰亞胺基團與巰基快速、特異性地結合，很可能聚乙二醇-馬來酰亞胺改性的納米顆粒能靶向細胞表面巰基，引起細胞內在化增強 27。使用聚乙二醇-硅烷如馬來酰亞胺-聚乙二醇-硅烷和不含有馬來酰亞胺基團的聚乙二醇-硅烷（甲氧基-聚 乙二醇-硅烷，2000Da)對Ti0 2-UCN進行表面改性，并對比在0SCC細胞中細胞結合和內在化 效率。結果顯示在最早3小時，攝入0SCC細胞的Mal-PEG_Ti0 2-UCN顯著增加（圖15D)。當細胞 表面巰基用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)預封端時，觀察到癌細胞中Mal-PEG_Ti0 2-UCN的內化 下降5倍（圖15E)。與不含有FBS的培養基相比，當存在10%FBS時，Mal-PEG_Ti0 2-UCN的攝取 并未受到顯著影響，但當存在50%FBS時，會下降約4倍(圖15F)。
[0087] 納米顆粒的暗毒性
[0088]人體0SCC細胞可用作體外、體內研究的模型，因為這些細胞的表皮生長因子受體 在細胞表面過度表達28,可利用這點，將這些開發的納米顆粒特異性地靶向這些癌細胞。未 處理的0SCC細胞和經濃度為ImM的Ti0 2-UCN或Mal-PEG_Ti02-UCN處理的細胞的細胞活性沒 有顯著不同（圖16A)。當濃度為2mM時，盡管其細胞活性仍高于80%，但也明顯低于未處理細 胞的細胞活性，當濃度非常高，為4mM時，其細胞活性下降50 %。同樣，除了當濃度高達2mM以 上時，未改性Ti〇2_UCN和表面改性Ti02-UCN的毒性沒有顯著差異，似乎聚乙二醇化Ti0 2-UCN 的毒性顯著低于未改性部分(P = 0.0082)。盡管，由于細胞大小和增長類型的區別，OSCC細 胞的細胞攝取和暗毒性不能與正常人成纖維(NHF)細胞相比，納米顆粒與NHF細胞共培養 時，也能觀察到相似的暗毒性趨勢（圖16B)。因為標準MTS( [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-( 4-磺苯基)-2H-四唑）增殖試驗只反映線粒體酶活性，基于死亡細 胞失去了細胞膜的完整性并且染料可滲透，使用臺盼藍拒染法評價這些納米顆粒的暗毒 性。未處理的OSCC細胞和經ImM Ti02-UCN或Mal-PEG_Ti02-UCN處理的細胞的細胞活性沒有 顯著不同，保持80%以上（圖16C)。此后，當濃度為2mM時，減少到60%。因此，在后續體外實 驗中，納米顆粒的最大濃度定為ImM。
[0089] 溶血試驗
[0090]使用紅細胞(RBC)溶解實驗對濃度在50μΜ-4πιΜ范圍內的納米顆粒的生物相容性進 行評估。如圖16D所示，Ti02-UCN和Mal-PEG_Ti02-UCN在血紅蛋白釋放上都表現出劑量依賴 性增加。然而，濃度大于50μΜ的Ti0 2-UCN引起的RBC溶解明顯大于Mal-PEG_Ti02-UCN。用4mM Ti0 2-UCN處理的RBC的溶血百分水平為21.7 %。另一方面，在研究的濃度范圍內，由Ma 1 -PEG-Ti02_UCN引起的血紅蛋白釋放遠低于5%。這表明，PEG改性Ti02-UCN中表現出優異的血 液相容性，適用于體內應用。
[0091] 體外TOT和細胞死亡
[0092] 在評估合成納米顆粒的roT效果之前，有必要優化PDT參數，如光劑量、輻照時間， 使得NIR光本身不會殺死細胞。為實現這一點，將0SCC細胞置于不同劑量980nm NIR激光下， 以確定細胞能承受的且不利于當納米顆粒存在時的細胞的劑量。因為，在此，光催化劑Ti〇2 由上轉化UV光間接激發(反斯托克斯方案)而不是常規PDT中的直接UV激發，由于上轉換過 程效率低，所需要的激發功率相對較高 29。結果發現，0SCC細胞能耐受的是:NIR激光功率 1.2W且連續輻照5分鐘20秒(功率密度~2. lW/cm2)、光通量傳遞675J/cm2(圖17)，細胞活性 大于95%。同時，在lmMMal-PEG-Ti0 2-UCN存在下，使用這種優化的光劑量進行輻照，可殺 死約80 %的細胞。激光功率的進一步降低，福照時間的進一步增加不會打破這樣一個適當 平衡，因此得出這樣一個假設，存在UCN核所需要的最小閾值激發功率密度，小于該值時，不 能主動上轉換和激發殼中的Ti0 2來生成足夠的R0S以有效殺死細胞。另一方面，激發功率密 度的進一步增加會引起細胞熱衰退。采用優化光參數的0SCC細胞體外roT表明當濃度為ImM 時，Mal-PEG-Ti02-UCN(78%)比Ti02-UCN(56%)引發明顯更多的細胞死亡（圖18A)。因此， Ti02-UCN的表面改性顯著提高體內Ti02-UCN PDT的療效。
[0093] 為進一步證明細胞死亡確實由UCN上Ti02殼經光活化后生成的R0S引起的，定量評 價在細胞輻照后30分鐘內生成的R0S。在980nm光存在下，濃度為ImM的Mal-PEG_Ti02-UCN較 Ti02-UCN生成更大量R0S，由于癌細胞對這些納米顆粒更大量的攝取，PDT療效更好（圖 18B)。此外，在Mal-PEG_Ti0 2-UCN情況下，R0S的生成存在相當大的劑量依賴性。此外，結果 發現，當Mal-PEG_Ti02-UCN培養較短時間（1小時），大部分顆粒依附到細胞膜上，細胞對這 些納米顆粒的攝取最小（圖19A-C)。然而，6小時培養后，大部分顆粒存在細胞內，主要在細 胞質中。當比較細胞活性時，可觀察到只用Mal-PEG_Ti0 2-UCN培養1小時，PDT治療后，細胞 死亡率約為50 %。然而，6小時培養后進行TOT治療，細胞死亡更為明顯(>70 % )。這個觀察與 體外納米顆粒攝取數據一致，6小時培養期后，對納米顆粒的攝取更高，因此TOT治療后細胞 殺死率更大。
[0094] 下面的討論是關于使用本發明中納米顆粒時細胞死亡機制理論，但并不是為了進 行限制。據知，根據細胞類型、PS的本質和位置及光劑量，PDT通過細胞凋亡、壞死和自噬以 誘導細胞死亡。未處理的0SCC細胞和僅經NIR光輻照的細胞用臺盼藍染色，在30分鐘輻照 下，似乎很少的細胞會吸收藍色染料（圖18C)。然而，當這些細胞用Mal-PEG_Ti0 2-UCN培養6 小時，接著用NIR光輻照，在30分鐘處理過程中，大多數細胞染成藍色，說明雖然細胞保持其 形狀，但細胞膜完整性喪失。NIR光輻照后的6小時，細胞膜滲色和細胞膜完全破裂，表明細 胞死亡的壞死途徑中嚴重的細胞損傷。
[0095] 控制UCN構建物上PS的負載量和獲得足量PS的穩定負載已成為阻礙UCN基TOT納米 平臺轉變為臨床上更相當大的進步的主要瓶頸。本發明中的方法和組合物保證形成具有明 確定義核殼結構的納米構建物，其中單個單分散UCN核被含量可精確控制的薄薄的Ti〇2層 圍繞著。體外結果清楚地表明這種生物相容的納米構建物在NIR引發深部組織roT中具有應 用潛力。
[0096] 實施例
[0097]實施例1上轉換納米顆粒的合成
[0098]恥￥?4:20%￥13,0.5%1'111納米晶的合成過程如下：將￥(：13(0.8111111〇1)、￥13(：1 3 (0.2mmol)和TmCl3(0·005mmol)與油酸6mL和十八烯（0DE)15mL在50mL燒瓶中混合。將溶液 加熱至160°C形成均相溶液，然后冷卻至室溫。將含有Na0H(2.5mmol)和NH4F(4mmol)的甲醇 溶液10mL緩慢加入到燒瓶中，攪拌30分鐘。隨后，將該溶液緩慢加熱除去甲醇，100°C下脫氣 10分鐘，然后在氮氣保護下加熱到300 °C并保溫1小時。當該溶液自然冷卻后，使用乙醇將納 米晶從溶液中沉淀出來，用乙醇/水（1:1，v/v)洗滌3次。將⑶-520 0 . lmL、環己烷6mL和 0.01M NaYF4納米微球的環己烷溶液4mL混合，攪拌10分鐘。然后加入IGEPAL C0-520(壬基 酚聚氧乙烯（5)醚，分枝)0.4mL和氨水0.08mL，將容器密封并超聲20分鐘直至形成透明乳 液。將正硅酸乙酯（TE0S)0.04mL加入到溶液中，將溶液在600rpm轉速下旋轉2天。加入丙酮 沉淀NaYF4@Si0 2納米微球，納米微球用乙醇/水（1:1，v/v)洗滌2次，然后儲存在水中。
[0099]實施例2上轉換納米顆粒上的Ti02包覆層
[0100] 為了進一步包覆無定形的Ti〇2層，通過將NaYF4@Si02接枝(3-氨基丙基)三乙氧基 硅烷(APS)，使用氨基對二氧化硅表面進行改性。在NaYF4@Ti0 2納米結構的典型合成過程 中，將NaYF4@Si02納米顆粒0.02mmol分散在異丙醇（IPA) 10mL、氨水（28wt % )0.3mL和水 2.5mL中。然后，將雙（乙酰丙酮基）二異丙基鈦酸酯溶液(異丙醇中0.001M)2mL緩慢加入到 上述溶液中，在室溫（20°C)下攪拌24小時。然后，通過離心收集包覆無定形Ti0 2的納米顆 粒，用IPA溶液洗滌兩次。為了獲得結晶Ti02殼，在封閉高壓釜中，將NaYF4@Ti0 2納米顆粒空 氣氣氛中180°C下用乙醇處理24小時。
[0101] 實施例3熒光分光光度法
[0102] 使用裝備有1200g mm-1光柵和連續波（CW)980nm二極管激光器的SpectroPro 2150i分光光度計(Roper Scientific Acton Research,馬薩諸塞)測量納米顆粒的焚光光 譜。將納米顆粒分別再懸浮于水、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、含有10%或不含胎牛血清的達爾 伯克氏改良伊格爾(DMEM)培養基等不同溶液中，用分光光度計進行測量。
[0103] 使用馬來酰亞胺-聚乙二醇-硅烷對Ti〇2-UCN進行表面改性。將4mg的馬來酰亞胺-聚乙二醇-硅烷(Nanocs公司，美國，紐約）溶于4mL水中，向其中加入溶于4mL乙醇的Ti0 2-UCN 4mg。隨后，加入TEOS 10yL，將溶液在室溫下攪拌30分鐘。攪拌結束時，向溶液中滴加氨 水(28wt%)150uL，在室溫下再攪拌3小時。然后在10°C下，將溶液以8000rpm離心10分鐘收 集Mal-PEG_Ti0 2-UCN，用乙醇洗滌兩次，儲存在4°C。為了對比，使用相同的方案，對不含有 馬來酰亞胺基團的聚乙二醇-硅烷（甲氧基-聚乙二醇-硅烷_2000Da，Nanocs公司，美國，紐 約)進行表面改性。
[0104] 合成的納米顆粒的表征。使用JE0L 2010透射電鏡在200V的加速電壓下對合成的 納米顆粒的大小和形貌進行表征。使用裝備有1200g/mm光柵和980nm VA-II二極管栗浦固 態（DPSS)激光器的SpectroPro 2150i分光光度計（Roper Scientific Acton Research,馬 薩諸塞)記錄熒光光譜。使用島津IRPrestige-21模型光譜儀（日本島津公司，日本，京都)記 錄FT-IR光譜。使用Zetasizer(Nano ZS,Malvern Instruments公司，英國）進行動態光散 射，用以測量流體動力學直徑、PDI、Zeta電位。去離子水中濃度為lmg/mL的納米顆粒在水、 PBS、RPMI以及含有10%PBS的RPMI進一步稀釋（100ug/mL)前，超聲20分鐘，以確定隨時間變 化的平均團聚體尺寸。
[0105]溶液中R0S生成的測量。為了測量未改性和改性Ti02的R0S生成能力，氨基苯基熒 光素(APF)(分子探針，美國）用作指示劑。將roS中濃度為lmg/mL的UCN超聲20分鐘，將APF染 料加入到UCN懸浮液中，最終濃度為10μΜ。在使用波長為515nm的紫外可見分光光度計 (Photonitech，新加坡)進行福照之前，測定懸浮液在490nm激發下的焚光，作為時間0小時 (t = 0)時的熒光強度。然后將懸浮液在980nm NIR光、功率1.2W下輻照60小時，每隔20分鐘， 測量熒光。因為生成的R0S的量與APF的熒光強度成正比，熒光強度為曝光時間的函數。
[0106] 為了證明組織的穿透能力，將不同厚度(6-10mm)的組織模擬體放置于NIR或UV入 射光的路徑上進行相同的實驗。簡單地說，使用〇. 5 % (w/v)超純瓊脂糖（Invi trogen)、1 % (v/v)的脂肪乳劑10%(kabivitrum)作為散射劑和0.1% (v/v)黑色素作吸收劑制備組織模 擬體。與不存在組織模擬體時，使用NIR或UV光直接照射樣品相比，當組織模擬體存在時， NIR和UV光的組織穿透和R0S生成能力表示為lmg/mL Mal-PEG_Ti02-UCN在輻照下的R0S生 成量的下降百分比。
[0107] 凝膠電泳和銀染。使用含有10%FBS的RPMI和含有100%FBS的RPMI將濃度為lmg/ mL的納米顆粒(Ti02-UCN和Mal-PEG_Ti02-UCN)處理24小時。在10%甘油中，懸浮液呈現良好 分層，以15000rpm離心15分鐘。收集顆粒，再懸浮于200μ1去離子水中。使用2 XLaemml i樣 品緩沖液(Bio-Rad公司，美國）處理相同體積的樣品，在95 °C加熱5分鐘以減少二硫鍵。然 后，將這些樣品加載于5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)凝膠中，在 120V下分離SDS-變性蛋白2.5小時。在制造商的指導下，使用皮爾斯銀染試劑盒（Thermo Scientific，美國）對蛋白帶進行銀染。
[0108] 細胞系。03〇：(0六1^-27)、小鼠白血病單核巨噬細胞系(1^1 264.7)和順?細胞（頂1?-90)購于美國模式培養物保藏所(ATCC，美國）。細胞在RPMI-1640培養基(0SCC細胞)和DMEM 培養基(DMEM)(巨噬細胞和NHF細胞）中培養。用10%胎牛血清、1 %青霉素鏈霉素補充培養 基。細胞在含有5 % C02的潮濕大氣中保溫37 °C。
[0109] 體外巨噬細胞攝取試驗。將RAW 264.7小鼠巨噬細胞接種于8孔腔室玻片，細胞密 度為25X 103個細胞/孔，培養過夜，使細胞粘附于孔的底部。孔中的培養基可替換為10% FBS 補充 DMEM中的濃度為 ImM (270yg/mL)的納米顆粒（T i 02-UCN 或 Ma 1-PEG-T i 02-UCN)懸浮 液，且將該懸浮液在37 °C培養1小時。然后，將該巨噬細胞用1 X PBS沖洗三次以洗去多余的 未攝入的納米顆粒，在冰冷的甲醇中固定10分鐘。使用濃度為5yg/mL的麥胚凝集素 ，Alexa F_lu〇i*?488共輒物（分子探針公司，美國）對質膜染色10分鐘。核進一步用500nM碘化丙啶 (分子探針公司，USA)染色5分鐘。細胞用PBS輕輕地洗三次，使用Vectashield安裝培養基 (載體實驗室，美國，加利福尼亞州）安裝。使用裝有980nm激光寬場熒光插件(EINST公司，新 加坡）的直立的尼康80i熒光顯微鏡(尼康，日本，東京）在20X目鏡(放大200X)，將巨噬細胞 對未改性和改性Ti0 2-UCN攝取成像。在汞弧燈的激發下，利用分別設置的標準的FITC和 TRITC濾波器，細胞的質膜和細胞核變得可視。通過使用Image J 1.47V軟件(美國國家健康 研究所)測量UCN整體熒光強度，來對比巨噬細胞對未改性和改性Ti0 2-UCN的攝取。
[0110] 體外暗毒性測量。將0SCC細胞和NHF細胞接種于96孔板，細胞密度為8X103個細 胞/孔，培養過夜，使細胞粘附于板的底部。在無菌PBS中制備濃度為lmg/mL的納米顆粒 (Ti0 2-UCN或Mal-PEG_Ti02-UCN)，超聲20分鐘，然后在加入到細胞之前，用含有10%FBS的 RPMI稀釋，濃度變化范圍為10yM(2.7yg/mL)-4mM(1.08mg/mL)。細胞進一步在37°C培養6小 時，之后，用1XPBS輕輕地洗滌3次，除去納米顆粒、用新鮮的培養基替換。在37°C下培養24 小時之后，采用MTS法，根據提供商的指導，使用CellTit er96@AQue〇us單溶液細胞增殖檢 測(Promega公司，美國，威斯康辛州，麥迪遜)試劑盒確定存活的細胞數。細胞存活率百分比 數值是相對于未處理的對照細胞來說的。
[0111] 臺盼藍染色，將8 X 1040SCC細胞接種于12孔板，用上述納米顆粒處理。以1200rpm 離心5分鐘采集每個孔中的細胞。然后，使用PBS中0.4%臺盼藍溶液染色5分鐘，接著用雙室 血細胞計數池和光學顯微鏡計數。記錄細胞總數和死（藍色）細胞數，對三個獨立細胞計數 的平均數進行匯總分析。根據如下公式確定活細胞的百分比。活細胞的百分比=100 X [(細 胞總數-死細胞數)/對照未經處理孔中的平均細胞數)]。
[0112] 溶血試驗。雌性balb/c裸鼠，6_8周齡，體重17克，來臺灣BioLasco。通過心臟穿刺 獲取新鮮血液lmL)。本研究中，所有程序得到中國科學院生化與細胞所實驗動物管理委 員會(IACUC)、新加坡保健集團的認可，符合國際標準。在4°C下，將血漿以1500rpm離心分離 得到紅細胞(RBC)。分離得到的RBC進一步用無菌PBS離心洗滌3次，直至上清液清澈，并再懸 浮于2mL PBS中。然后將PBS中濃度為50μΜ-4πιΜ的納米顆粒（Ti〇2_UCN和Mal-PEG-Ti〇2_UCN) 懸浮液l〇〇yL加入到RBS懸浮液100yL中。在37°C下不斷搖晃2小時，將該懸浮液在1500rpm下 離心15分鐘。隨后，用酶標儀在波長576nm下對每個離心管中的上清液100yL進行血紅蛋白 釋放分析。在相同實驗條件下進行對照實驗，其中將RBC懸浮液100yL加入ros 100yL作為陰 性對照，加入到0.5 % Triton X-100 100yL作為陽性對照。使用下列公式計算溶血百分比：
[0113] 溶血（％ ) = (0D576樣品-0D576陰性對照）/(0D576陽性對照-0D576陰性對照）X 100%
[0114] 納米顆粒的體外攝取。將0SCC細胞接種于145cm2細胞培養皿中，密度為3X106個 細胞每皿，37°C下培養過夜。使用濃度為ImM UCN處理細胞3小時、6小時、24小時;之后，除去 含有未內化納米顆粒的培養基，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞3次。然后，采集細胞，使用ICP- AES測量鈦含量以測量細胞內所攝取的納米顆粒。
[0115] 納米顆粒的吸收成像，將0SCC細胞和NHF細胞接種于8孔室玻片，培養過夜;之后， 用濃度為ImM的Mal-PEG_Ti0 2-UCN處理6小時。然后，將細胞在冰冷的甲醇中固定10分鐘;使 用麥胚凝集素，AleXaFluor?488共輒物和碘化丙啶對質膜和核染色，洗滌，封片，在汞弧燈 的激發下，使用尼康80i熒光顯微鏡（尼康，日本，東京），40X目鏡（放大400X)，標準FITC、 TRITC和DAPI濾光鏡套件成像。此外，使用Image J 1.47v軟件（美國國家健康研究所)測量 UCN總體熒光強度，以量化在不同培養條件下0SCC細胞對Mal-PEG_Ti02-UCN和Met-PEG-Ti0 2-UCN的攝取。為了檢驗NEM對Met-PEG_Ti02-UCN細胞攝取的影響，在不含血清的RPMI中， 用InM NEM預阻滯0SCC細胞15分鐘，然后用ImM Mal-PEG-Ti〇2_UCN培養6小時。
[0116] 體外TOT。將0SCC細胞接種于96孔細胞培養板，細胞密度為8X103個細胞/孔。在37 °C過夜培養后，使用ΙΟμΜ-lmM范圍內的不同濃度的未改性和表面改性Ti0 2-UCN處理細胞6 小時。除去含有未內化納米顆粒的培養基，用PBS洗滌細胞3次，用新鮮的培養基替換。使用 980nm NIR光、功率1.2W、總通量傳遞675J/cm2下輻照細胞5分鐘20秒。將細胞再培養24小 時，然后根據提供商的指導，使用〇6111'；^619()@4( >)1160118單溶液細胞增殖檢測(？1'011168&公 司，美國，威斯康辛州，麥迪遜)試劑盒確定相對于對照未處理細胞的細胞存活百分比。
[0117] 體外R0S生成的測量。使用Ti〇2-UCN或Mal-PEG-Ti〇2-UCN進行體外PDT之后，在供應 商指導下使用oxiselect?體外R0S/RNS檢測試劑盒(cellbiolabs公司，美國）測量R0S的生 成量。簡單地說，將0SCC細胞接種于96孔細胞培養板，細胞密度為8 X 103個細胞/孔。在37 °C 下過夜培養后，使用Ti〇2_UCN或Mal-PEG_Ti02-UCN處理細胞6小時。之后，除去培養基，用100 yL非熒光-2 '，7 '-二氯熒光素(DCFH)替換1小時。然后，用1 X PBS輕輕地沖洗細胞三次，將新 鮮的培養基加入到每個孔中，隨后使用上述相同光劑量的980nm NIR光進行輻照。通過測量 生成的2'，7'_二氯熒光素的量，采用熒光分光光度法測量細胞中生成的R0S，并與預測定 DCF標準曲線對比。
[one]細胞死亡模式的評估。為了研究體外tot后的細胞死亡模式，在處理后間隔不同的 時間（30分鐘和6小時），用PBS中0.1 %臺盼藍對0SCC細胞輕度復染5分鐘。然后，用1 Xros輕 輕地洗滌細胞一次，用HBSS封片，立即使用配有尼康DS-Ri 1相機的亮場顯微鏡進行可視 化。
[0119]統計分析。在所有附圖中，數據點表示平均數土標準差（SD)。使用GraphPad Prism6.0軟件(GraphPad軟件，美國加利福尼亞圣迭戈)進行數據統計分析。使用雙尾未成 對t檢驗，或在Bonf erroni事后檢驗之后使用兩因素方差分析比較平均數的不同。當P值小 于0.05(P<0.05)時，認為是顯著的。
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[0156] 在這里引用的所有專利的內容，已公布的應用和參考文獻通過整體引用包含于 此。
[0157] 通過參考實施例，具體示出和描述了本發明，本領域的普通技術人員應當理解，在 不超出所附權利要求書涵蓋的本發明的范圍的情況下，所公開的實施例可以有不同的形式 和內容的變化。
【主權項】
1. 一種用于光動力學療法的納米復合材料，包括： 上轉換納米顆粒，其中所述納米顆粒在近紅外光激發下，發射出波長約330nm-約675nm 的光;和 所述納米顆粒外表面上的連續均勻的外包覆層，所述包覆層包括半導體材料，其中所 述納米顆粒的發射光的波長足以將一個或多個電子從半導體材料的價帶激發到半導體材 料的導帶上，而且，被激發后，所述半導體材料的能量足夠以生成至少一種活性氧類。2. 如權利要求1所述的納米復合材料，其中所述納米顆粒包含摻雜約lOmol %-約 30mol%Yb3+和約 0.3mol/%_ 約 2mol/%Tm3+的 NaYF4 納米晶體。3. 如權利要求2所述的納米復合材料，其中Y: Yb: Tm的摩爾比是79.5:20:0.5。4. 如權利要求1所述的納米復合材料，其中所述半導體材料是Ti02。5. 如權利要求1所述的納米復合材料，該納米復合材料還包括中間包覆層，其中所述中 間包覆層位于所述上轉換納米顆粒和包含半導體材料的外包覆層之間。6. 如權利要求1所述的納米復合材料，其中所述納米復合材料用革E1向劑改性。7. 如權利要求6所述的納米復合材料，其中所述靶向劑通過連接基團與所述半導體表 面連接。8. 如權利要求7所述的納米復合材料，其中所述連接基團是聚乙二醇。9. 如權利要求8所述的納米復合材料，其中所述革E1向劑是親和體、抗體、適配體或肽。10. -種用于光動力學療法的組合物，包括： 革巴向劑，該革G向劑與包含納米復合材料的支架相連，其中所述納米復合材料包括： 上轉換納米顆粒，其中所述納米顆粒在近紅外光激發下，發射出波長約330nm-約675nm 的光;和 所述納米顆粒外表面上連續的外包覆層，所述包覆層包括半導體材料，其中所述納米 顆粒的發射光的波長足以將一個或多個電子從半導體材料的價帶激發到半導體材料的導 帶上，而且，被激發后，所述半導體材料的能量足夠以生成至少一種活性氧類。11. 如權利要求10所述的組合物，其中所述靶向劑可選擇地通過連接基團與所述半導 體表面連接。12. -種生成活性氧類的方法，包括： 用近紅外光照射包含如權利要求1所述的納米復合材料的樣品和一種或多種選自水或 氧的氧源一段時間，足以將一個或多個電子從半導體材料的價帶激發到半導體材料的導帶 上，其中所述一種或多種氧源發生氧化還原反應，形成活性氧類。13. -種納米復合材料組合物，包括： 多個如權利要求1所述的納米復合材料，其中所述納米復合材料均勾地分布在所述組 合物中，而且進一步地，其中所述納米復合材料的形狀和大小均一。14. 如權利要求7所述的納米復合材料，其中所述連接基團是一種分散穩定劑。15. 如權利要求14所述的納米復合材料，其中所述分散穩定劑是聚乙二醇。16. 如權利要求15所述的納米復合材料，其中所述分散穩定劑的分子量是2000Da或更 尚。17. -種使用光動力學療法治療對象體內生物靶的方法，包括： 給對象施用治療有效量的如權利要求1所述的納米復合材料； 將所述納米復合材料暴露在近紅外光中足以使所述納米復合材料顆粒發射出波長約 330nm-約675nm的光，這樣，生成的至少一種活性氧類治療對象體內的生物靶。18.如權利要求17所述的方法，其中所述生物靶是癌細胞中過度表達的細胞表面受體。
【文檔編號】A61K9/14GK105939708SQ201480072476
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年12月30日
【發明人】張勇, 李正全, 尼格拉·穆罕默德伊德瑞斯, 蘇啟智, 薩斯德哈蘭·斯瓦納拉薩·拉奇
【申請人】新加坡國立大學