兩親性熊果酸-多糖偶聯物的制備及其在腫瘤治療中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種具有抗腫瘤活性的兩親性熊果酸-多糖偶聯物的制備及其應用。熊果酸通過化學改造將C3位的羧基取代為氨基，所生成的氨基化的熊果酸化學偶聯到多糖骨架上，形成兩親性熊果酸-多糖偶聯物，在水中可以自組裝成納米膠束，其特征包括：1)通過化學改造的熊果酸的抗腫瘤活性明顯增強；2)疏水基團所形成的疏水內核可以物理包裹抗腫瘤藥物，明顯改善抗腫瘤藥物的溶解性；3)通過化學偶聯熊果酸及物理包裹其他抗腫瘤藥物，可實現聯合化療，增強抗腫瘤活性，達到聯合增效的作用，降低毒性。本發明制備方法簡單，容易操作，產率較高，容易實現工業化。
【專利說明】兩親性熊果酸-多糖偶聯物的制備及其在腫瘤治療中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于藥物制劑領域，具體涉及兩親性熊果酸-多糖偶聯物的制備及其在腫瘤治療中的應用。
【背景技術】
[0002]在當今全球范圍內，癌癥已經成為人類死亡的主要原因。世界衛生組織指出，目前癌癥每年在全球奪取700多萬人的生命，而且這一數字還會繼續上升。因此，對于癌癥的治療和研究刻不容緩，是新世紀人類急需解決的難題。目前，癌癥的治療手段主要是手術治療和化學藥物治療，但是手術治療只能切除肉眼可見的腫瘤，化療藥物的水溶性較差，口服生物利用度低，體內代謝較快，對癌細胞缺乏靶向性，具有較大的毒副作用。
[0003]熊果酸是一種弱酸性五環三萜類化合物，具有抗氧化、抗炎、保肝、降血脂等作用。近年來發現，熊果酸能夠抑制多種惡性腫瘤細胞的生長。體外研究表明，熊果酸可抑制血管生成，是很強的血管生成抑制劑。用20%胎牛血清的培養液使血管內皮細胞(VEC)呈指數生長狀態，137.06~1096.5 μ mol.L—1的熊果酸對VEC增殖具有抑制作用，并有劑量依賴性。李希波等人研究發現熊果酸對裸鼠肺腺癌移植瘤生長有抑制作用，其機制可能與降低移植瘤促血管生成因子VEGF的表達、抑制新生血管的形成和促進腫瘤細胞凋亡有關。此外，熊果酸對多種腫瘤細胞具有明顯的誘導細胞凋亡作用而被人們重視，研究增多。例如，熊果酸通過Caspase-3，8，9誘導HT-29細胞凋亡，通過p53通路誘導人小細胞肺癌A459凋亡等。研究發現，熊果酸C3位羥基和C17位羧基是熊果酸維持抗腫瘤活性的關鍵基團。將熊果酸C3位羥基取代為剛2后，其對人原髓白血病HL-60細胞、人胃癌BGC細胞、人肝癌Bel-7402細胞及Hela細胞的ED5tl分別為2.0,2.5,1.7、和2.4mg / L，熊果酸則為72.0、53.7,45.0和49.4mg/L。因此，分析其構效關系可知，將熊果酸C3位的羥基取代為NH2后，熊果酸的抗腫瘤活性顯著增強。此外，熊果酸資源廣，毒性反應少，越來越受到大家的關注。但是，熊果酸難溶于水，導致其制劑制備困難`和生物利用低等問題，因此提高難溶性熊果酸的溶解度，進而提高其生物利用度成為一個熱點和難點。
[0004]多糖是所有生命有機體的重要組成部分，在控制細胞分裂，誘導細胞分化以及維持生命體正常代謝方面有著重要的意義。此外，由于多糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，主鏈結構由于存在大量的活性基團(如羧基和氨基等)易于化學修飾而改善其理化性質等優點，被越來越多的修飾成兩親性偶聯物。例如，透明質酸是一種由葡萄醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的雙糖單位反復交替連接構成的線性大分子粘多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性、高粘彈性，并且能與細胞表面某些特異性受體專一性結合，因此，經透明質酸改造的藥物載體具有良好的生物相容性、靶向性、緩釋性以及高載藥量等優勢。肝素及其衍生物是由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替組成酸性粘多糖硫酸酯，具有良好的水溶性，因其結構上含有大量的羥基和羧基，易于進行結構修飾。[0005]藥物-多糖偶聯物是將疏水性的化療藥物和水溶性多糖通過化學共價鍵偶聯形成高分子藥物，其主要優勢在于:對實體瘤具有傾向性沉積作用，即EPR效應；延長藥物在血液的循環時間，避免網狀內皮系統的吞噬；改善疏水性藥物可溶性等。例如，將熊果酸與透明質酸偶聯，所形成的兩親性熊果酸-透明質酸偶聯物，其不僅可以在水中發生自組裝，形成內部疏水外部親水的膠束結構，增加熊果酸的水溶性，還可以通過與細胞表面透明質酸受體特異性結合的能力以及透明質酸受體介導的內吞作用，實現藥物的主動靶向傳遞。肝素及其衍生物具有抑制腫瘤血管生成、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤的生長和轉移等作用，因此，熊果酸-肝素偶聯物不僅可解決熊果酸的溶解性問題，亦可發揮協同抗腫瘤作用，增強其抑制腫瘤生長的活性。
[0006]兩親性熊果酸-多糖偶聯物可以在水溶液中自組裝，形成內部疏水、外部親水的膠束結構，其疏水性的內核可以裝載疏水性的藥物，達到增溶的目的。多糖通過化學偶聯氨基化的熊果酸，以及物理包裹其他抗腫瘤藥物，可以達到協同治療的效果，從而提高療效。因此，兩親性熊果酸-多糖偶聯物不僅可以單獨用作制備高分子藥物，還可以作為藥學活性或藥理活性分子的載體。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種熊果酸-多糖類兩親性偶聯物，通過化學改造將熊果酸結構上的羥基取代為氨基并且通過化學偶聯的方法，將疏水性的氨基化的熊果酸接枝到多糖骨架上，形成兩親性熊果酸-多糖偶聯物。同時，該偶聯物是是安全性好、載藥量高、生物活性好的抗腫瘤藥物載體。該體系顯著增強了熊果酸的抗腫瘤活性，而且大大提高了熊果酸的水溶性，避免了網狀內皮系統的吞噬，延長其在體內的循環時間，提高了熊果酸的生物利用度。本發明使熊果酸和多糖的應用具有更廣闊的產業化前景。
[0008]本發明的另一個目的是提供上述兩親性熊果酸-多糖偶聯物的制備方法。
[0009]本發明的還有一個目的是提供上述兩親性熊果酸-多糖偶聯物在抗腫瘤中的應用。
[0010]為了達到上述發明目的，本發明提供一種兩親性熊果酸-多糖偶聯物，該體系將熊果酸C3位上的羥基取代成氨基，形成氨基化的熊果酸。在多糖的羧基上，通過化學偶聯的方法，引入氨基化的熊果酸，形成兩親性熊果酸-多糖偶聯物。由于對熊果酸進行了化學改造，所形成的氨基化的熊果酸的抗腫瘤活性顯著增加，并且由于在親水性的多糖骨架上引入了疏水基團，增加了其兩親性，故兩親性熊果酸-多糖偶聯物能在水中自組裝形成納米膠束，提高了熊果酸的水溶性和穩定性，延長其在血液中的循環時間，增加熊果酸的抗腫瘤作用。
[0011]所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯物，其中多糖選自低分子量肝素、脫硫酸化肝素、未分級肝素、透明質酸、海藻酸、軟骨素、多硫酸化軟骨素、羧甲基殼聚糖、羧乙基殼聚糖、季銨化羧甲基殼聚糖、N-辛基-0，N-羧甲基殼聚糖、羧甲基葡聚糖或羧甲基香菇多糖。
[0012]所述的兩親性熊果酸-多糖的制備方法，包括以下步驟:
[0013]熊果酸通過氧化反應，將羥基氧化成羰基，所形成的3-羰基的熊果酸與鹽酸羥胺溶解于吡啶中，反應生成白色固體，該白色固體與氰基硼氫化鈉(NaBH3CN),乙酸鈉(CH3COONa)和三氯化鈦(TiCl3)溶解于甲醇中，反應生成氨基化的熊果酸。將多糖溶于反應溶劑中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)為活化劑，進行縮合反應將氨基化的熊果酸接枝到多糖骨架上。
[0014]所述的制備方法中，氧化反應的氧化劑為氯鉻酸吡啶(PCC)，溶劑為二氯甲烷，或者氧化反應的氧化劑為瓊斯(Jones)試劑，溶劑為二氯甲烷-丙酮。
[0015]所述的制備方法，其中反應溶劑選自水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺與水或甲酰胺與水、或N，N- 二甲基甲酰胺與甲酰胺的混合溶劑。
[0016]所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯物，可單獨用作高分子藥物，也可用作藥學活性或者藥理活性分子的藥物載體。
[0017]所述的藥學活性或者藥理活性分子選自紫杉烷類、喜樹堿類、長春新堿類、蒽醌類、鬼白毒素類、阿霉素類或維A酸類抗腫瘤藥物。
[0018]所制備的高分子藥物或包載疏水性藥學活性或藥理活性分子的兩親性熊果酸-多糖偶聯物為注射劑、片劑、膠囊劑、口服溶液劑、貼劑、搽劑、洗劑、凝膠劑、涂劑、軟膏劑、噴霧劑、氣霧劑或鼻用制劑。
[0019]該兩親性熊果酸-多糖偶聯物制成載藥納米膠束的方法操作步驟如下:兩親性熊果酸-多糖偶聯物與水按重量比為3~50: 1000的比例溶解，得到兩親性多糖偶聯物納米膠束；將治療有效量的難溶或微溶于水的抗腫瘤藥物用藥學上可接受的溶劑溶解，與所述的熊果酸-多糖納米膠束混合后，經超聲或高壓均質處理，溶液用透析法或超濾法或柱分離法除去有機溶劑小分子得到粒徑為10~1000nm的納米膠束，得到的納米膠束可直接應用，也可通過冷凍干燥或噴霧干燥制成固體制劑。
[0020]具體方案如下:
[0021]在多糖分子的骨架上引入氨基化的熊果酸，使其具有兩親性，在水性介質中可自組裝成納米膠束，其中疏水的氨基化熊果酸聚集成內核，而多糖分子形成親水性外殼，故得到的納米膠束具有性質穩定、有效地逃避網狀內皮系統吞噬、高抗腫瘤活性等特征。同時，該兩親性熊果酸-多糖偶聯物還是一種優良的藥物載體，可物理包裹難溶性抗腫瘤藥物。該偶聯物作為藥物載體，粒徑在10~1000nm可控，均勻度好，再分散性好，載藥量高。該偶聯物可用于注射、口服、外用或粘膜給藥。
[0022]所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯物的具體制備方法如下:
[0023]一、氨基取代的熊果酸衍生物的合成
[0024]1.熊果酸用二氯甲烷溶解，一定溫度下逐步滴入溶解有氧化劑的溶液中，室溫攪拌一定時間。反應液經過濾，洗滌，水洗，干燥，過濾，濃縮后，硅膠柱層析洗脫、濃縮，得白色固體；
[0025]2. 將反應I得到的白色固體和鹽酸羥胺溶解于吡啶中，一定溫度下回流一定時間。待反應液冷卻至室溫后，蒸餾水洗滌，過濾，水洗，干燥，得白色固體；
[0026]3.將反應2得到的白色固體、氰基硼氫化鈉和乙酸鈉，溶解于甲醇中，氮氣保護下反應。冰浴條件下，緩慢滴加三氯化鈦溶液，室溫攪拌一定時間。將所得的白色渾濁液，加入適量的蒸餾水，旋去甲醇，調節溶液PH至中性，用二氯甲烷萃取，有機層水洗，干燥，過濾，濾液濃縮。用甲醇、二氯甲烷和石油醚的混合溶劑重結晶，得白色固體，即氨基化的熊果酸。
[0027]合成路線如下:
[0028]
【權利要求】
1.一種兩親性熊果酸-多糖偶聯物，其特征在于該兩親性熊果酸-多糖偶聯物是通過以下方法制備得到的:熊果酸通過化學改造得到氨基化的熊果酸，其抗腫瘤活性顯著增強；在多糖上的羧基引入氨基化的熊果酸，使其具有兩親性，在水性介質中可自組裝形成納米膠束。
2.根據權利要求1所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯物，其特征在于該兩親性熊果酸-多糖偶聯物中所述的多糖包括低分子量肝素、脫硫酸化肝素、未分級肝素、透明質酸、海藻酸、軟骨素、多硫酸化軟骨素、羧甲基殼聚糖、羧乙基殼聚糖、季銨化羧甲基殼聚糖、N-辛基-O，N-羧甲基殼聚糖、羧甲基葡聚糖或羧甲基香菇多糖。
3.根據權利要求1所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯物，其特征在于該兩親性熊果酸-多糖偶聯物的制備方法包括以下步驟: ①熊果酸用二氯甲烷溶解，一定溫度下逐步滴入溶解有氧化劑的溶液中，室溫攪拌一定時間。反應液經過濾，洗滌，水洗，干燥，過濾，濃縮后，硅膠柱層析洗脫、濃縮，得白色固體； ②將反應①得到的白色固體和鹽酸羥胺溶解于吡啶中，一定溫度下回流一定時間。待反應液冷卻至室溫后，蒸餾水洗滌，過濾，水洗，干燥，得白色固體； ③將反應②得到的白色固體、氰基硼氫化鈉和乙酸鈉，溶解于甲醇中，氮氣保護下反應。冰浴條件下，緩慢滴加三氯化鈦溶液，室溫攪拌一定時間。將所得的白色渾濁液，加入適量的蒸餾水，旋去甲醇，調節溶液PH至中性，用二氯甲烷萃取，有機層水洗，干燥，過濾，濾液濃縮。用甲醇、二 氯甲烷和石油醚的混合溶劑重結晶，得白色固體，即氨基化的熊果酸； ④將多糖溶于反應溶劑，在氮氣保護下，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺為催化劑，加入氨基化的熊果酸，控制反應至反應完全，反應結束后，用沉淀劑沉淀，過濾得到沉淀物，復溶，超聲，透析，冷凍干燥，即得熊果酸-多糖類兩親性偶聯物。
4.根據權利要求2所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯物的制備方法，其特征在于: 步驟①中，所述的氧化反應的氧化劑為氯鉻酸吡啶，溶劑為二氯甲烷，或者氧化反應的氧化劑為瓊斯試劑，溶劑為二氯甲烷-丙酮；所述的溫度控制為-10~30°C，所述的室溫攪拌時間為0.5~IOh ； 步驟②中，所述的溫度控制為80~150°C ;所述的回流時間為2~24h ; 步驟③中，所述的室溫攪拌時間為2~36h ; 步驟④中，所述的反應溶劑選自水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺與水或甲酰胺與水、或N，N-二甲基甲酰胺與甲酰胺的混合溶劑，所述的控制反應為先加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺活化劑反應0.2~2h后，再加入氨基化的熊果酸，室溫反應6~72h ;所述的沉淀劑選自冰丙酮、冰乙醚、冰乙酸乙酯或冰乙醇。
5.權利要求1所述的兩親性熊果酸-多糖偶聯物，其特征在于其可以單獨用作制備高分子藥物，或者用作制備疏水性藥學活性或藥理活性分子的載體中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所制備的高分子藥物或包載疏水性藥學活性或藥理活性分子的兩親性熊果酸-多糖偶聯物為注射劑、片劑、膠囊劑、口服溶液劑、貼劑、搽劑、洗劑、凝膠劑、涂劑、軟膏劑、噴霧劑、氣霧劑或鼻用制劑。
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述的藥學活性或藥理活性分子選自:紫杉烷類、喜樹堿類、長春新堿類、蒽醌類、鬼白毒素類、阿霉素類或維A酸類抗腫瘤藥物。
8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于兩親性熊果酸-多糖偶聯物制備載藥納米膠束的方法包括如下步驟:兩親性熊果酸-多糖偶聯物與水按重量比為3~50: 1000的比例溶解，得到熊果酸-多糖納米膠束；將治療有效量的難溶或微溶于水的抗腫瘤藥物用藥學上可接受的溶劑溶解，與所述的熊果酸-多糖納米膠束混合后，經超聲或高壓均質處理，溶液用透析法或超濾法或柱分離法除去有機溶劑小分子得到粒徑為10~1000nm的納米膠束；得到的納米膠束可直接應用，也可通過冷凍干燥或噴霧干燥制成固體制劑復溶后再利用。`
【文檔編號】A61K31/56GK103705939SQ201310742882
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月30日 優先權日:2013年12月30日
【發明者】姚靜, 李園珂, 周建平 申請人:中國藥科大學