作為肺鱗狀細胞癌標志物的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白b13的制作方法

專利名稱：作為肺鱗狀細胞癌標志物的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白b13的制作方法
作為肺鱗狀細胞癌標志物的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13本發明涉及一種輔助評估鱗狀細胞癌(=SCC)的方法。其公開了蛋白質絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13作為SCC標志物的應用。此外，其涉及一種評估從患有非小細胞肺癌 (=NSCLC)的患者中獲得的組織樣品中的肺癌以及將肺腺癌或大細胞癌與SCC區分開的方法。盡管在檢測和治療方面取得了進展，癌癥仍然是主要的公眾衛生挑戰。在各種癌癥類型中，LC在西方世界是常發癌癥并且是癌癥相關死亡率的最常見原因之一。它是美國男性和女性兩者中癌癥相關死亡的最常見原因。它主要是一種老年疾病發病率隨年齡增加，> 65歲時達到482/100，000人，并且峰值為75歲，達到約502/100，000人。65歲的人形成肺癌的風險為25歲的人的50倍，并且是45-64歲的人的3_4倍。男性中大約90%以及女性中大約80%的肺癌病例都歸因于吸煙。肺癌的風險與總吸煙年數有關，吸煙將吸煙者暴露于致癌物和促進劑中。由于細胞DNA修復的年齡相關性下降，風險在老年人中也會增加。從初次接觸吸煙到臨床癥狀，肺癌可能有15-20年的自然史。大部分LC腫瘤可分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，NSCLC又再分為三種主要的組織學腫瘤類型，即鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌。SCLC占所有肺癌病例的約20-25%。SCLC是攻擊性的神經內分泌型LC并且具有很差的預后，即使在早期檢測出。SCLC極少順應通過切除的根治性治療。由于該疾病發展的速度，SCLC通常僅使用兩個時期(即局限和廣泛性疾病)而不用更復雜的 !分期系統 (見下面)來分類。大約75-80%的LC病例歸類入NSCLC類，包括鱗狀細胞癌(癌=CA)、腺CA (包括腺泡CA、乳頭狀CA、支氣管肺泡腫瘤、實體瘤和混合亞型的亞類)，和大細胞癌(包括巨細胞瘤、透明細胞CA、腺鱗CA和未分化CA的亞類)。NSCLC，如果在晚期檢測出，具有非常差的預后。癌癥的分期依據程度、進展、細胞類型和腫瘤等級對疾病分類。它將癌癥患者分組，使得可以作出關于預后和治療選擇的概括。今天， Μ系統是基于癌癥解剖學程度的最廣泛使用的分類系統。它代表國際認可、統一的分期系統。存在三個基本變量τ (原發性腫瘤的程度)、N(局部淋巴結的狀態) 和M(有或沒有遠端轉移)。
Μ標準由UICC(國際抗癌聯盟)公布(Sobin，L. H.和Fleming， I. D. ,TNM Classification of Malignant Tumors (惡性腫瘤的 TNM分類)，第五版(1997)， 第 1803-1804 頁)。原發性腫瘤的手術切除已被廣泛接受為選擇用于早期NSCLC的治療。隨著NSCLC 的發展，更具體地從 IIIa 期(T3mM0、TlN2M0、T2N2M0、T3N2M0)向 IIIb 期(T4N0M0、T4mM0、 T4N2M0)轉變，促使醫師方法的明顯轉變。但是，如果在更早期(Ia-IIIa ；優選最早T3mM0 期)檢測出癌癥，5年生存率在35%-80%之間變化。Ia期((T1N0M0)；腫瘤尺寸小、無轉移)的檢測明顯地具有最好的預后，五年生存率高達80%。手術極少，如果有的話，用在NSCLC的Inb-IV期的處理中。IV期對應于遠端轉移，即疾病擴散到肺和局部淋巴結以外。較晚的III和IV期的5年生存率分別降至小于15% 和之間。尤其重要的是，NSCLC的早期診斷轉化成好得多的預后。早在Ia(TlNOMO)、 Ib (T2N0M0)、IIa(TlNlMO)、lib (T3N0M0)和 IIIa(T3NlM0)期診斷出的患者，如果處理恰當， 診斷后5年具有高達80%的生存機會。這應與當遠端轉移已經存在時確診的患者小于
的5年生存率比較。越早診斷出LC，長期生存的機會越大。如上所述，病理學家將肺癌分類為4種主要的組織學類型，S卩，鱗狀細胞癌、腺癌、 大細胞癌(總稱=NSCLC)和小細胞癌。但是，相當重要的是要注意通常，這些類型中的兩種或多種同時出現并且組織學分類極度依賴于所負責的病理學家的技能。急需可有助于對多種類型肺癌進行更具重現性分類的另外的方法。特別是指示 NSCLC腫瘤組別內的SCC的標志物，表示輔助這種診斷的重要工具。已出乎意料地發現，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標志物代表了評估肺癌的極好的工具。通過使用絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標志物，例如可能將鱗狀細胞癌與肺癌的其它組織學類型(例如腺癌)區分。發明概述在一個實施方案中，本發明涉及一種用于體外評估肺鱗狀細胞癌(SCC)的方法， 包括(a)測定測試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(b)將步驟(a)的測定結果用于評估肺鱗狀細胞癌，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽性測定結果指示肺鱗狀細胞癌。還描述了一種用于體外評估肺鱗狀細胞癌的方法，包括(a)測定測試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，(b)測定對照樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(c)在評估肺鱗狀細胞癌中比較步驟(a)和(b)的測定結果，其中與對照樣品中的水平相比，所述測試樣品中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B水平升高指示肺鱗狀細胞癌。本發明還公開了一種用于在體外相對于其它非小細胞肺癌(NSCLC)鑒別診斷肺鱗狀細胞癌的方法，包括(a)測定包含非小細胞肺癌細胞的測試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，以及(b)利用步驟(a)的測定結果用于相對于其它NSCLC鑒別診斷鱗狀細胞癌，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽性測定結果指示肺鱗狀細胞癌，而絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陰性測定結果指示其它NSCLC。本發明還涉及絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標志物在評估肺鱗狀細胞癌以及將肺鱗狀細胞癌與其它類型NSCLC(如肺腺癌)區分中的應用。發明詳述在優選實施方案中，本發明涉及一種用于體外評估肺鱗狀細胞癌的方法，包括 (a)測定測試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(b)將步驟(a)的測定結果用于評估肺鱗狀細胞癌，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽性測定結果指示肺鱗狀細胞癌。術語“測定”或“測量”涉及樣品中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的定性或定量測量。 在優選實施方案中，測量為定性或半定量測量，即確定絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13是存在還是不存在或者確定絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的濃度是高于還是低于截斷值(cut-off value)。如本領域技術人員將理解的，在是(存在)或否(不存在)的測定中，通常設置測定靈敏度以匹配截斷值。例如可從一組健康個體的測試中確定截斷值。優選地，設置截斷值以導致產生90%的特異性，還優選設置截斷值以導致產生95%的特異性，或還優選設置截斷值以導致產生98%的特異性。高于截斷值的值的存在可例如指示肺鱗狀細胞癌的存在。如果確定的值高于截斷值，則將測定結果歸類為陽性。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白(蛋白酶抑制劑13、HaCaT UV-阻遏型絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、hurpin、headpin ；絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 ；SWISS-PR0T檢索號 Q9UIV8)是44. 3kDa的蛋白質并由391個氨基酸組成，由SEQ ID NO=I表征。由可變剪接產生的一種同工型(38.4kDa，339aa)在文獻中報道(SEQ ID NO :2)。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白13屬于廣泛分布的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(絲氨酸蛋白酶抑制劑)的蛋白質超家族。通常，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白是利用構象變化來抑制靶標酶(主要為絲氨酸蛋白酶) 的蛋白酶抑制劑。具體而言，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13被報道分別抑制組織蛋白酶K 禾口 L(Welss，Τ.等，Biochemistry 42(2003)7381—7389 ；Jayakumar, Α.等，Arch. Biochem. Biophys. 409(2003)367-374)。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白13最初作為HaCaT細胞中的UV阻遏型基因被發現(Abts, H. F.等，J. Mol. Biol. 293 (1999) 29-39)。獨立地，它被稱為 “headpin” 并且相應的基因被其他作者繪圖于染色體18q上(Spring，P.等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 264(1999099-304)。在此研究中，RNA印跡分析和相關RT-PCR揭示，與正常鱗狀上皮相比，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的mRNA表達在口腔鱗狀細胞癌中被減量調節。基于RT-PCR分析的早期研究揭示，與未受影響的皮膚相比，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13在患銀屑病患者受影響的皮膚中過量表達(Abts，H. F.等，J. Mol. Biol. 293 (199909-39)。在更近期的研究中，這些發現通過蛋白質印跡和IHC在蛋白水平上證實。在正常的皮膚中，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13主要在基底層中表達(Moussali， H.等，Exp. Dermatol. 14(2005)420-428) 絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的分布和表達水平在銀屑病皮膚中是不同的；已發現在顆粒層中表達最高。在相同的研究中，作者報道絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13在皮膚紅斑狼瘡和惡性腫瘤中過量表達。此外，這些作者用RT-PCR證實了他們的發現。在另一個研究中，分析了絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的表達與其靶標蛋白酶 Cat L 的關系(Bylaite, M.等，Exp. Dermatol. 15 (2006) 110-118)。作者再次顯示，與正常組織相比，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的表達在皮膚惡性腫瘤中增加并重新分布；但是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的表達與Cat L沒有直接的關系。最近，ffalz,M.等人(Exp. Dermatol. 16(2007)715-723)產生了轉基因小鼠，所述轉基因小鼠除了表達內源性鼠絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以外還表達人絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。這些轉基因小鼠的特征在于化學致癌作用后腹部皮毛異常及皮膚癌易感性較高。這些發現暗示絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13在皮膚疾病發展中的重要作用。如對技術人員顯而易見的，本發明不應解釋為受限于SEQ ID NO 1的全長蛋白絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的生理學或人工片段、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的二次修飾以及絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的等位基因變體也被本發明包括。多肽的變體由相同的基因編碼，但其等電點(=PI)或分子量(=MW)或兩者可不同， 例如因選擇性mRNA或前mRNA加工所致。變體的氨基酸序列與相應的標志物序列95%以上相同。人工片段優選包含合成或通過重組技術產生的肽，其至少包含一個診斷關注的表位，該表位由如從SEQ ID N0:1中公開的序列獲得的至少6、7、8、9或10個連續氨基酸組成。 這種片段可有利地用于抗體的產生或作為免疫測定中的標準品。本文所用每個下面的術語都具有與其在該部分中有關的含義。冠詞“一”和“一個”在本文中用于指一個或多于一個(即至少一個)冠詞的語法賓語。舉例來說，“標志物”意指一個標志物或多于一個標志物。術語“至少”用以表示任選地可存在一個或多個其它對象。表述“一個或多個”表示1-50個，優選1-20個，也優選2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或 15個。本文所用的術語“標志物”或“生化標志物”是指待用作用于分析患者測試樣品的靶標的分子。在一個實施方案中，這種分子靶標的實例為蛋白質或多肽。在本發明中用作標志物的蛋白質或多肽考慮包括所述蛋白質天然存在的變體以及所述蛋白質或所述變體的片段，特別是，免疫學上可檢測的片段。免疫學上可檢測的片段優選包含所述標志物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20個連續氨基酸。本領域技術人員將意識到，由細胞釋放的或存在于細胞外基質中的蛋白質可被破壞，例如在炎癥過程中，并可被降解或切割成這類片段。 某些標志物以非活性形式合成，隨后可由蛋白酶解活化。如本領域技術人員將意識到，蛋白質或其片段也可作為復合體的部分存在。在本發明的意思內，這種復合體也可用作標志物。 另外或備選地，標志物多肽或其變體可帶有翻譯后修飾。優選的翻譯后修飾為糖基化、酰化和/或磷酸化。優選通過利用特異性結合劑從樣品中特異地測定標志物絲氨酸蛋白酶抑制蛋白 B13。特異性結合劑例如絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的受體，是結合絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的凝集素或絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的抗體。優選使用結合絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的兩種同工型的特異性結合劑。特異性結合劑對其相應的靶標分子具有至少IO7I/ mol的親和力。該特異性結合劑對其靶標分子優選具有IO8Vmol的親和力或也優選IO9I/ mol的親和力。如本領域技術人員將意識到，術語特異性用來表示存在于樣品中的其它生物分子不顯著地結合對絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特異的結合劑。優選地，結合靶標分子以外的生物分子的水平導致結合親和力，該結合親和力最高分別為靶標分子親和力的僅10% 以下、僅5%以下、僅2%以下或者僅以下。優選的特異性結合劑將同時符合上述關于親和力和特異性的最低標準。特異性結合劑優選為與絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13反應的抗體。術語抗體是指多克隆抗體、單克隆抗體、這些抗體的抗原結合片段、單鏈抗體和包含抗體結合域的遺傳構建體。可使用特異性結合劑的保留上述標準的任意抗體片段。抗體由現有技術方法產生，例如，如 Tijssen 所描述白勺方法(Tijssen，P.，Practice and theory of enzyme immunoassays(酶免疫測定的實踐和原理)，11，Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam，整本書，尤其是第43-78頁)。另外，技術人員熟知基于可用于抗體的特異性分離的免疫吸附劑的方法。通過這些方法，多克隆抗體的質量和從而其在免疫測定中的性能可得到提高(Ti jssen, P.，見上，第108-115頁)。為獲得如本發明所公開的成果，可使用在兔中產生的多克隆抗體。但是，同樣清楚
6的是，也可使用來自不同物種(例如，大鼠或豚鼠)的多克隆抗體，以及單克隆抗體。由于可以以所需的任意量產生具有恒定性質的單克隆抗體，其代表了臨床常規測定開發中的理想工具。針對絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的單克隆抗體的產生和使用以及其在本發明方法中的使用，分別代表了其它優選的實施方案。本文所用的術語“測試樣品”是指用于體外評估目的而從個體獲得的生物學樣品。術語“評估肺鱗狀細胞癌”用以表示，根據本發明的方法將(單獨或與其它標志物或變量，例如由UICC給出的標準(見上面)一起)例如幫助醫師建立或確定SCC的不存在或存在。如本領域技術人員將意識到的，在體外作出任何這種評估。然后丟棄患者樣品。患者樣品僅用于本發明的體外診斷方法，并且患者樣品材料并不轉移回患者體內。典型地，該樣品為包含細胞的樣品。免疫組織化學領域的技術人員將意識到，染料批次變化和某些環境條件例如相對濕度的差異性，可影響使用本發明方法在不同時間獲得的結果。在本發明方法的某些實施方案中，試劑和批次間的差異性通過使用相同試劑對測試樣品細胞和合適的對照樣品細胞進行染色來控制。在優選實施方案中，本發明涉及一種體外評估SCC的方法，包括測定單個測試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及利用測定結果評估SCC。在一些情形中，除了從患者中獲得測試樣品外，提供對照樣品也可能會有幫助。這類對照樣品可為陰性對照樣品、陽性對照樣品或包含這些對照類型中的一種或多種的混合對照。陰性對照樣品優選包含正常肺組織、多種亞型的肺癌如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺大細胞癌或其多種組合。陽性對照樣品優選包含分類為肺鱗狀細胞癌的組織。在優選實施方案中，本發明公開了一種用于體外評估肺鱗狀細胞癌的方法，包括 (a)測定測試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，(b)測定陰性對照樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(c)在評估肺鱗狀細胞癌中，將步驟(a)和(b)的測定結果進行比較， 其中與陰性對照樣品中的水平相比，所述測試樣品中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13水平升高指示肺鱗狀細胞癌。如上面所指出，在某些情形中包含肺鱗狀細胞癌的樣品可用作陽性對照并且優選與待研究樣品平行測定。在這種情形中，陽性對照樣品中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽性結果表明該測試程序在技術水平上起作用。在這些條件下測試樣品對于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽性染色，測試樣品指示潛在的惡性腫瘤為SCC。本發明的發明人令人意想不到地能夠證明，標志物蛋白絲氨酸蛋白酶抑制蛋白 B13顯示與肺鱗狀細胞癌的強烈相關。考慮對不同類型肺癌(尤其是SCC)進行分類的不確定性，可能恰當的是，針對絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的染色可成為評估患有NSCLC的患者以及將其分類為SCC和其它“非SCC”肺癌的關鍵標準之一。用于評估特定臨床(疾病)實體的理想情況會是以下情形，其中單一事件或過程將導致相應的疾病，如例如在大多數傳染性疾病中。在所有其它情況中，正確的診斷可能非常困難，尤其是當疾病的病因學未被完全明白時，如LC的情形。如本領域技術人員將意識到，沒有生化標志物對于既定多因素疾病例如對于LC的診斷有100%的特異性同時又具有 100%的靈敏度。但是，可將生化標志物例如CYFRA21-l、CEA、NSE、proGRP或本文所示的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，用于以某種可能性或預測值評估例如疾病的存在、不存在或嚴重性。因此在常規臨床診斷中，在評估潛在疾病時通常一起考慮各種臨床癥狀和生物學標志物。有經驗的病理學家可容易地將肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩種主要種類。但是，難以進一步細分腫瘤亞型，尤其是對最初發現患有NSCLC的患者。如上所述， NSCLC被理解為包含三種主要的疾病亞群鱗狀細胞癌、腺CA和大細胞癌。本發明公開了一種有助于將鱗狀細胞癌與所有其它類型的NSCLC(即非SCC的NSCLC)區分的診斷方法。在另一個實施方案中，本發明公開了一種用于在體外相對于其它類型的NSCLC對鱗狀細胞癌進行鑒別診斷的方法，包括(a)測定包含非小細胞肺癌細胞的測試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及(b)利用步驟(a)的測定結果用于相對于其它NSCLC對鱗狀細胞癌進行鑒別診斷，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽性測定結果指示肺鱗狀細胞癌而絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陰性測定結果則指示其它類型的NSCLC。在本發明方法中，測試樣品或患者樣品優選為包含細胞的樣品，例如組織樣品。優選地，測試樣品為如通過活組織檢查或手術獲得的組織塊。同樣優選的是，這種測試樣品為組織切片。備選地，細胞可通過進行支氣管肺泡灌洗從肺中獲得，它們可通過適于收集上皮襯液(包含細胞)的設備抽出，或可從唾液中獲得細胞。在優選實施方案中，本發明和本文公開的各種方法因而涉及包含細胞的測試樣品，所述細胞從支氣管肺泡灌洗或上皮襯液中獲得。包含細胞的測試樣品可經歷多種分析途徑。在一個優選實施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13將在原位即在測試樣品的細胞或組織內進行測定；在另一個優選實施方案中，可溶解測試樣品的細胞并在細胞或組織裂解液中測定絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。對于原位測定絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，優選將包含待研究細胞的測試樣品裝在顯微鏡載玻片上。在一個實施方案中，這種樣品可為不用甲醛固定和沒有包埋(例如沒有包埋在石蠟中)的樣品，例如技術人員已知分別為新鮮的組織樣品或新鮮的冰凍組織樣品的樣品。但是，在臨床常規中，優選包含細胞的樣品接受標準化的固定和/或包埋程序。在優選方式中，本發明的方法基于已用福爾馬林固定和石蠟包埋的測試樣品來實施。對技術人員來說顯而易見的是，先前已固定和包埋的樣品必須經過預處理以至少除去包埋材料。 如果進一步需要，在免疫組織化學領域，多種方法處于可用于重新獲得例如免疫可檢測表位的情況(stake)。這類方法被技術人員統稱為抗原恢復的方法。如果必須研究可能包含或懷疑包含肺贅生性細胞的測試樣品，則無疑應使用本發明的方法。在優選實施方案中，本發明用被懷疑含有贅生性細胞的測試樣品來實施。每當要原位(在細胞表面或內部、在組織切片中等等)測定絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13時，這樣的測定中使用的方法將優選為任何合適的免疫組織化學方法。在優選實施方案中，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13通過免疫染色方法進行測定。癌癥診斷，在治療之前、期間或之后的疾病的最初診斷和病程的后續監測兩者，傳統上通過對從患者中移除的細胞或組織樣品的組織學檢查來確定。臨床病理學家需要能夠準確地測定這類樣品是良性還是惡性，以及對被視為惡性的腫瘤樣品的攻擊性進行分類，因為這些測定常形成選擇合適的患者治療過程的基礎。類似地，病理學家需要能夠檢測癌癥已經生長程度，或尤其由于治療(最特別地用用化療劑或生物制劑的治療)所致進入緩解的程度。組織學檢查傳統上需要組織染色程序，該程序使得樣品的形態學特征在光學顯微鏡下容易觀察。在檢查染色樣品后，病理學家通常作出腫瘤樣品是否為惡性的定性決定。但是，僅通過樣品的組織學檢查難以確定腫瘤的攻擊性，因為腫瘤的攻擊性常為腫瘤內細胞的生物化學結果，例如蛋白質的表達或阻抑以及蛋白質活化，其可能會或不會受到樣品的形態學影響。因此，能夠評估腫瘤樣品內細胞的生物化學是重要的。另外，期望能夠對腫瘤相關基因或蛋白兩者分別進行觀察和定量。在本發明方法的實施中，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13可用自身可檢測地標記的特異性試劑(最優選抗體)進行檢測，或利用未標記的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特異性抗體和可檢測地標記并識別絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特異性抗體的第二抗體來進行檢測。 通常在顯微鏡下由有經驗的病理學家評估染色的細胞或組織樣品。在本發明方法的優選實施方案中，使用雙組分免疫組織化學染色系統來區別地染色絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13和組織或細胞樣品，使得染色的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 可以更容易地與復染的組織或細胞樣品區分。免疫組織化學染色后，優選由計算機輔助圖像分析系統生成的組織或細胞樣品的光學圖像，接著在光學顯微鏡下放大并分成圖像對。 分開的圖像用一對光學過濾器增強，一個過濾器具有與著色劑相應的最大吸收而另一個過濾器具有與復染劑相應的最大吸收，從而在兩種著色劑之間提供最佳的區別。本領域已知的自動(計算機輔助)圖像分析系統可增強樣品的目視檢查。在典型的系統中，將細胞或組織樣品暴露于對特定生物學標志物特異的可檢測地標記的試劑中，然后細胞的放大圖像由計算機進行處理，該計算機自電荷耦合器件(CCD)或照相機(例如電視攝象機)接收圖像。這種系統可用來檢測和測定樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的水平。這種方法論提供了更準確的癌癥診斷和更佳地表征在組織學鑒定的癌細胞中的基因表達。組織樣品的定量免疫組織化學圖像分析的示例性程序的描述可大體上參見WO 01/519 和WO 01/51928，兩者均通過引用以其整體結合到本文中。舉例來說，定量圖像分析可在從 Becton Dickinson Company, Mountain View, Calif■購買的 Cell Analysis Systems Model 200 (細胞分析系統模型200)上進行。如本發明所包括的，定量圖像分析可在來自其它廠商的系統上進行，例如但不限于ChromaVision Medical Systems (Chroma Vision 醫學系統)(San Juan Capistrano, Calif.)。在某些實施方案中，本發明方法利用如下的圖像分析系統來實施。在如上所述的免疫組織化學染色后，可通過數字化染色樣品的顯微圖像，以及將數字化圖像的每個圖像元素(像素)的光強度值轉化為對應染色細胞組分(例如核)百分比的光密度值，來定量測定表達細胞的百分比。更具體地，使用數字灰度圖像，計算機化的圖像分析可用以確定具有特定染色的細胞量。灰度圖像代表了光增強因子(例如色原)的量，光學增強因子結合正在研究的特定靶標，從而使靶標可光學放大和顯像。在第一步中，細胞中任何表達的靶標蛋白如下鑒定通過加入對靶標蛋白特異的可檢測地標記的第一抗體，或備選地未標記的第一抗體和對第一抗體特異的可檢測地標記的第二抗體。抗體與樣品溫育一段時間以形成復合體，如果這些抗原存在的話。接著通過直接檢測標記，或者如果可檢測標記為酶，則將該部分與化合物例如色原在合適條件下進行溫育，來使復合物可見。例如，第一抗體可用過氧化物酶標記，隨后使用色原DAB。在第二步中，將組織用另一光學增強因子復染，例如但不限于乙綠。盡管使用過氧化物酶和乙綠的染色技術堪稱模范，但是其它著色劑和光學增強因子也是合適的。例如，其它色原可與過氧化物酶使用，包括但不限于3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)，其產生紅色和4-氯-1萘酚。另外，可用于標記第一抗體的其它酶由本發明包括，包括但不限于堿性磷酸酶。可與堿性磷酸酶使用的色原的實例，包括但不限于固紅、固綠和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/氮藍四唑 (BCIP/NBT)。此外，熒光染料的使用由本發明方法所包括。熒光染料的非限制性實例為熒光素(異硫氰酸熒光素或FITC)和羅丹明。此外，乙綠的使用是復染劑的模范，但其它復染劑可用在本發明方法中。例如，另外的復染劑的非限制性名單包括蘇木精、固紅、甲基綠。基于可獲得的光譜分離選擇復染劑用于特定的染色，使得在兩個獨立的波長處可獲得過濾。例如，乙綠提供與DAB沉淀物良好的光譜分離，如下面更詳細的描述。提供良好色譜分離的著色劑/復染劑對的其它實例包括但不限于固紅和蘇木精、AEC和蘇木精以及FITC和德克薩斯紅(Texas Red)。本領域技術人員認可的是，此著色劑和復染劑名單僅為示范性的，因此不起限制本發明的作用。如上所述，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13也可從測試樣品中測定，其中細胞已溶解或以其它方式處理以釋放絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。在優選實施方案中，測試樣品經處理以釋放絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，并通過免疫測定程序測定絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13。 絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13可在溶解的樣品中測定的優選免疫測定方法為酶聯免疫吸附測定(ELISA)、基于化學發光的免疫測定(例如來自Roche的Elecsys )或蛋白質印跡。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標志物在評估肺鱗狀細胞癌中的應用代表了本發明的另一個優選實施方案。也優選的是，在來自先前被分類為患有非小細胞肺癌的患者的組織樣品中，使用絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標志物將肺鱗狀細胞癌與其它類型肺非小細胞癌區分開患者。提供以下實施例、序列表和圖來幫助理解本發明，其真實范圍在所附權利要求中給出。應理解，可對給出的方法作出修改而不背離本發明的精神。序列表的描述SEQ ID NO 1 顯示了絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白的氨基酸序列3kDa ； 391 個氨基酸；SWISS-PR0T 檢索號Q9UIV8)。SEQ ID NO 2顯示了由可變剪接產生的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白同工型的氨基酸序列(38. 4kDa, 339個氨基酸)。SEQ ID NO 3 正向引物LC5for_EcoRI (用于EcoRI克隆位點、核糖體結合位點和 N-末端肽突出端(其示于SEQ ID NO :5中)的特征)。SEQ ID NO 4 反向引物 LC5rev-HindIII。SEQ ID NO 5 N-末端肽突出端。


圖1分別顯示了 10名SCC患者和10名腺Ca患者的蛋白質印跡的結果(對絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13進行免疫染色)。明顯地，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的信號強度在全部10名分類為SCC的患者的腫瘤組織裂解液中增加，而在腺Ca中，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白僅在1名患者中可檢測到或根本不存在。圖2將來自分類為患有SCC的肺癌患者的組織切片與從分類為患有肺腺Ca的肺癌患者中得到的組織切片進行比較。所示分別為3名不同的SCC患者(面板A)和3名不同腺Ca患者(面板B)的組織切片結果。強烈的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特異性染色在所有SCC樣品中觀察到，而在腺Ca切片中沒有可見的染色。正常肺組織(例如SCC中的腫瘤組織附近)是絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13陰性的。實施例1針對絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的抗體的產生產生絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的多克隆抗體，用于在免疫檢測測定例如蛋白質印跡法和IHC中，進一步使用抗體。a)大腸桿菌中重組蛋白的表達為了產生針對絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的抗體，在大腸桿菌中產生重組抗原。因此，利用正向引物LC5for-EcoRI和反向引物LC5rev-HindIII，從獲得自German Resource Center for Genome Research (德國基因組研究資源中心)(RZPD，Berlin, Germany)的全長cDNA克隆DKFZp686E1318Q2中PCR擴增絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13編碼區從，所述 LC5for-EcoRI 為 5，ATGCGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCA TCACCATCACATTGAAGGCCGTGATTCACTTGGCGCCGTCAGCACTC(SEQ ID NO 3) (EcoRI-位點和起始密碼子加下劃線)，所述 LC5rev-HindIII 為 5，GCATAAGCTTTCATTAAGGAGAAGAAAATCTGCCGAAG AAG (SEQ ID NO 4) (HindIII 位點加下劃線)。將編碼N-末端MRGSHHHHHHIEGR(SEQ ID NO 5)肽突出端的正向引物特征(除了 EcoRI克隆位點和核糖體結合位點)寡核苷酸，符合讀框地引入絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 多肽。將 EcoRI/Hindlll 消化的 PCR 片段連接到相應 pQE-30 (Qiagen，Hilden，Germany)載體片段內，所述載體片段隨后轉化到大腸桿菌XLl-blue感受態細胞中。分析序列后，按照制造商的說明書，將質粒轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，用于在pQE載體系列的IPTG 誘導型T5啟動子下表達。為純化MRGSHHHHHHIEGR-絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13融合蛋白，將11誘導過夜的細菌培養物通過離心沉淀，將細胞沉淀通過重懸于PH 8. 0的IOOmM磷酸鈉緩沖液、7M鹽酸胍、5mM咪唑、20mM硫代甘油中裂解。通過離心沉淀不溶物質并將上清液加入鎳-氨基三乙酸(Ni-NTA)金屬親和層析中用數個柱床體積的裂解緩沖液洗滌柱，然后用以下溶液沖洗a) IOOmM磷酸鈉緩沖液，pH 8. 0, IOmM Tris-HCl,pH 8. 0，8M脲，20mM硫代甘油；b) IOOmM 磷酸鹽緩沖液，PH 8. 0,0. 5%十二烷基硫酸鈉(SDS)，20mM硫代甘油；和c) IOOmM磷酸鈉緩沖液，pH 8.0,0. SDS，20mM硫代甘油。最后，用IOOmM磷酸鈉緩沖液，pH 5.0,0. 1% SDS, 20mM硫代甘油在酸性條件洗脫結合的抗原，并貯存于4°C相同緩沖液中。b)多克隆抗體的產生免疫制備蛋白質溶液(100μ g/ml絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13蛋白)和完全弗氏助劑按1 1的比例的新鮮乳液，用于免疫。每只兔用Iml乳液在1、7、14和30、60、90天進行免疫。抽血，得到的抗絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13血清用于如實施例2和3所描述的進一
11步試驗。實施例2利用實施例1中描述的多克隆抗體在人肺癌組織中檢測絲氨酸蛋白酶抑制蛋白 B13的蛋白印跡組織制備將0.8-1. 2g冰凍組織切成小塊，轉移到混合器球磨機的冷凍研磨罐中并用液氮完全冷凍。組織在球磨機中被粉碎，溶于10倍體積(w/v)的裂解緩沖液(40mM檸檬酸鈉， 5mM MgCl2,1% Genapol X-080，0. 02%疊氮化鈉，無EDTA 的 Complete [Roche Diagnostics GmbH,Mannheim, Germany,目錄號1873580])中，接著在Wheaton 玻璃勻菜機中勻菜(20 X 松散配合，20X緊密配合)。將勻漿進行離心(5000X g，10分鐘)，上清液轉移到另一小瓶中并再次離心O0000Xg，15分鐘)。所得上清液包含可溶蛋白并用于進一步分析。SDS-PAGE和蛋白質印跡法利用hvitrogen，Karlsruhe, Germany的試劑和儀器進行。對每一個經測試的組織樣品，用還原性NuPAGE anvitrogerOSDS樣品緩沖液稀釋15 μ g組織裂解液，并在95°C加熱lOmin。在4-12%的NuPAGE 疑膠(Tris-甘氨酸) 上在MES運行緩沖系統中跑樣。凝膠分離的蛋白混合物用^witrogen XCell II Blot Module(Invitrogen)和NuPAGE 轉移緩沖系統點到硝酸纖維素膜上。膜在PBS/0. 05% Tween-20 中洗 3 次并用 Roti _Block 封閉緩沖液(A151. 1 ；Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)封閉池。第一抗體多克隆兔抗絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13血清(產生在實施例2 中描述)，以1 30，000用Roti -BloCk封閉緩沖液稀釋并與膜溫育lh。膜在PBS/0. 05% Tween-20中洗6次。特異性結合的第一兔抗體用POD-綴合的多克隆綿羊抗兔IgG抗體標記，用0. 5XRoti -BloCk封閉緩沖液稀釋至10mU/ml。溫育Ih后，膜在PBS/0. 05 % Tween-20中洗6次。為檢測結合的POD-綴合的抗兔抗體，將膜與Lumi-Lightpuis蛋白質印跡底物(定購號 2015196，Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)溫育并暴露于放射自顯影膜。10名SCC患者和10名腺Ca患者分別用WB進行分析(圖1)。顯然，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的信號強度在所有10名患者的腫瘤組織裂解物中增加，而在腺Ca中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的表達僅在1名患者中可檢測到。因此，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 在腫瘤組織中的SCC特異性過量表達由蛋白質印跡分析明確地顯示。實施例3利用實施例1描述的多克隆抗體檢測人肺癌組織中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13 的免疫組織化學(IHC)分析將石蠟包埋的組織切成2μπι的系列切片，在二甲苯中去除石蠟(3X5min)并通過一系列梯度乙醇再水化，然后用去離子水和PBS進行兩個沖洗步驟(lXanin)。抗原恢復用 Retrivit pH4. O (Innogenex)在 97 °C-100 °C 進行 20min。將切片冷卻 20min 并用 PBS (2 X Imin)漂洗。通過含3 % H2O2的PBS中中溫育5min阻斷內源性過氧化物酶的活性，然后將切片用PBS漂洗2次，接著用TBS+Tween 20 (LabVision 1666789)漂洗1次達 3min。室溫下用含馬血清的PBS(Horse-Blocking Serum,Vectastain ABC試劑盒，Elite Universal,Vector PK6200)阻斷免疫球蛋白的非特異性結合20min。按照制造商的說明書， 用生物素阻斷系統(Dako X0590)阻斷內源性生物素。為了對絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特異性染色，將切片與0.5 μ g/ml用抗體稀釋劑(Dako S2022)稀釋的多克隆抗體在4°C下溫育過夜。載玻片用TBS+Tween 20(LabVision 1666789)沖洗(3X ^iiin)，接著與生物素化的第二抗體(1 滴于 5ml PBS+1%馬血清中)(Vectastain ABC 試劑盒，Elite Universal, Vector PK6200)在室溫下溫育30min。用TBS+Tween 20沖洗(3Χ^ η)后，將切片與ABC 試劑(1滴試劑A加1滴試劑B于5ml PBS中)在室溫下溫育30min。載玻片用TBS+Tween 20(2X2min)沖洗，最后與二氨基聯苯胺色原溶液(DAB plus, Dako K3467)反應5min，在用蒸餾水漂洗后，將其用蘇木精復染并固定。兔IgG片段(Dako X0903)用作陰性對照。
將來自SCC的組織切片與從腺Ca獲得的組織切片進行比較。示例性地，圖2分別顯示了來自3名不同SCC患者(面板A)和來自3名腺Ca患者(面板B)的切片的結果。絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13特異性染色在所有SCC樣品中觀察到，而在腺Ca切片中則沒有染色。因而，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13在SCC腫瘤組織中的特異性表達由IHC分析明確地證實。
權利要求
1.一種用于體外評估肺鱗狀細胞癌的方法，包括a)測定測試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及b)將步驟(a)的測定結果用于評估肺鱗狀細胞癌，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽性測定結果指示肺鱗狀細胞癌。
2.一種用于體外評估肺鱗狀細胞癌的方法，包括a)測定測試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13，b)測定對照樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及c)在評估肺鱗狀細胞癌中，比較步驟(a)和(b)的測定結果，其中與所述對照樣品中的水平相比，所述測試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B的水平升高指示肺鱗狀細胞癌。
3.一種用于在體外相對于其它非小細胞肺癌(NSCLC)鑒別診斷肺鱗狀細胞癌的方法，包括a)測定包含非小細胞肺癌細胞的測試樣品中的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13以及b)將步驟(a)的測定結果用于相對于其它NSCLC鑒別診斷鱗狀細胞癌，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陽性測定結果指示肺鱗狀細胞癌，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的陰性測定結果指示其它NSCLC。
4.權利要求1-3之一的方法，其中所述測試樣品為通過活組織檢查獲得的組織塊。
5.權利要求4的方法，其中所述測試樣品為組織切片。
6.權利要求1-3之一的方法，其中所述測試樣品為支氣管肺泡灌洗或細胞外襯液。
7.權利要求4-6中任一項的方法，其中所述測試樣品固定在顯微鏡載玻片上。
8.權利要求7的方法，其中所述測試樣品已用福爾馬林固定和石蠟包埋。
9.權利要求1、3-8中任一項的方法，其中所述測試樣品懷疑或已知含有贅生性細胞。
10.權利要求1-9中任一項的方法，其中絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13通過免疫染色方法測定。
11.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述測試樣品經處理以釋放出絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13并且絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13通過免疫測定方法測定。
12.權利要求11的方法，其中所述免疫測定方法選自ELISA或蛋白質印跡。
13.絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標志物在評估肺鱗狀細胞癌中的用途。
14.絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13標志物的用途，用于在來自患者的組織樣品中將肺鱗狀細胞癌與肺腺癌區分，所述患者先前已被分類為患有非小細胞肺癌。
全文摘要
本發明涉及一種輔助評價鱗狀細胞癌(＝SCC)的方法。其公開了蛋白質絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B13作為SCC標志物的應用。另外，其涉及一種用于評估從患有非小細胞肺癌(＝NSCLC)患者中獲得的組織樣品中的肺癌的方法以及用于將SCC與肺腺癌或大細胞癌區分的方法。
文檔編號G01N33/574GK102341709SQ201080010654
公開日2012年2月1日 申請日期2010年3月2日 優先權日2009年3月4日
發明者L·曼托瓦尼-恩德爾, M·塔克, M·羅斯勒 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司