專利名稱：光譜學測定在脂立方樣品中膜蛋白穩定性的方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質基因工程技術領域，具體涉及一種通過光譜學測定脂立方樣品中的膜蛋白的活性以和穩定性的方法。
背景技術：
早在I960年研究者就已經證明，親水性和疏水性的兩性分子在水中可以形成很多形態各異結構的理論。1962年Iuzzati的研究組測定了層狀相的結構，也獲得了六角相的電子顯微結構。隨后不久，又用X射線技術測定了類脂立方相的結構。1968年Iuzzati與加拿大的研究專家對脂質-水體系(lipid-water system)進行了 X射線的研究,得到了脂質-水體系的隨脂質濃度和溫度變化的部分相圖。1980年Iarsson提出，立方液晶中無限循環排列的脂雙層膜非常類似于生物膜中的脂雙層膜。1990年Engtoom S.及其同事根據脂質立方液晶的結構特點，提出可以將類脂立方液晶用作藥物載體。脂質立方相(Lipidiccubic phase, LCP)應用于膜蛋白結晶最早是在1996年，Landau & Rosenbusch通過脂質立方相獲得了第一個完整的細菌視紫紅質蛋白的2.5埃的晶體結構。在此之后，通過脂質立方相結晶膜蛋白就成為一個很實用的技術，并被廣泛傳播。實踐證明，這項技術對于闡明膜蛋白的結構機制是至關重要的，近年來，通過LCP獲得了很多關鍵蛋白的結構信息，譬如，各種細菌視紫紅質蛋白以及第一個高分辨率的人源G蛋白偶聯受體(2-adrenergicreceptor)。運用脂質立方相能成功獲得高分辨率膜蛋白晶體，主要歸結為以下兩個原因:第一，與使用去垢劑與蛋白形成微球的惡劣環境不同，脂質立方相提供了一個更加接近天然的類似生物膜的環境；第二，在脂質立方相中，晶體生長時蛋白分子是按照I型堆積方式堆積，也就是蛋白分子不僅通過親水部位相互作用堆積，也通過疏水部位相互接觸而堆積，從而使得晶體結構更加有序，所含的水更少。到目前為止，通過LCP獲得的晶體結構達102個，蛋白種類達22種，晶型27種。因此，我們可以看出LCP為結構生物學研究提供了一個強有力的工具，在未來膜蛋白結構生物學研究中將扮演著舉足輕重的角色。在獲得更多的蛋白結晶并解析其結構的基礎上，我們可以來進行基于蛋白結構的藥物設計，從而更加有效快速的篩選潛在藥物，減少藥物研發的成本和周期，并且可以有效的提聞藥物的療效和減少藥物的副作用。熱穩定性越聞的蛋白，其相應結晶成功率也就越高。因此為了更好的用脂立方技術進行蛋白結晶實驗，篩選有前景的蛋白construct又是其中的重中之重。另外，脂立方主要的脂質和脂質添加劑，以及限定可能的沉淀劑和緩沖液的范圍，都有可能影響蛋白的熱穩定性。現有技術中，蛋白的熱穩定性測定辦法非常多，包括底物結合曲線，圓二色光譜，升溫曲線等等。然而這些技術都是基于蛋白在溶液中的情況，并不反映蛋白在脂立方樣品中的具體表現。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種方法設計合理、可操作性強、可以在脂立方樣品內直接測定膜蛋白的穩定性的方法。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種光譜學測定在脂立方樣品中膜蛋白穩定性的方法，其特點是，其步驟如下:
(1)表達和純化目標蛋白；在從^1網站上輸入目標膜蛋白名稱搜索序列，得到目標膜蛋白的全長基因序列；將全長序列導入相關細胞表達系統，然后進行純化，得到純化后的膜蛋白溶液；
(2)將膜蛋白溶液混入脂立方樣品；
①將純甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯與下述脂類分子中的一種組成的混合物從-20°C的冰箱取出中，加熱至37-40°C后形成液態；前述脂類分子選自1，2 - 二油酰-sn-甘油-3 -磷酸膽堿，1，2_ 二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺，1，2_ 二油酰-sn-甘油基-3 -磷脂酰甘油，1，2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰絲氨酸或者膽固醇；其中，純甘油一油酸酯占混合物質量的90%以上；
②將液態甘油一油酸酯或者混合物轉移到玻璃針管中冷卻至20-24°C，并立即與膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液樣品，將膜蛋白溶液樣品推過注射器的連接器以形成均勻的脂立方樣品；脂立方樣品中膜蛋白的最終濃度為0.5-2.0毫克/毫升，脂立方樣品中水的重量百分比為38-42% ;同時以不含前述膜蛋白的緩沖液作對照；
③當一個均勻和透明的脂立方樣品形成后，將50-70微升的脂立方樣品轉移到石英比色皿中，密封；在5600父8和18-22°C的條件下離心；
(3)膜蛋白在脂立方樣品中的穩定性測定；
采集石英比色皿中脂立方樣品的初始吸光度和內在蛋白熒光光譜后，立即對樣品進行升溫，升溫采用5-10°C為一升溫梯度`循序進行，每一梯度升溫進行后，需要采用前述方法離心并進行吸光度和內在蛋白熒光光譜采集；升溫的最高溫度不超過100°C;以不含膜蛋白的緩沖液按前述方法進行對照；將采集的吸光度和內在蛋白熒光光譜一起以圖表畫出，即可得到蛋白的退火溫度；退火溫度越高說明膜蛋白溫度性越高，反之亦然；從而實現膜蛋白穩定性的測定。本發明所述的方法中:步驟(2)所述的甘油一油酸酯與脂類分子混合物可以采用以下方法配制:將甘油一油酸酯與所述的脂類分子按比例置于適量的氯仿中，使用氮氣流蒸發大部分溶劑，隨后在真空21-23°C下處理至少12小時，除盡其余的殘留氯仿后，在-20°C下儲存。與現有技術相比，本發明的優點在于:
(I)本發明方法設計合理，可操作性強，可以實現在脂立方樣品中直接測定蛋白的穩定性，為隨后的晶體和相關研究提供了數據和理論的支持。(2)本發明方法中應用的基因也可以為蛋白已經各類小分子的控制研究提供支持。
圖1為在甘油一油酸酯和其它脂質分子組成的脂立方中，β 2腎上腺素受體，以及β 2腎上腺素受體-Τ4溶菌酶融合蛋白與噻嗎洛爾結合的熱穩定性 圖2為在甘油一油酸酯和不同的pH值緩沖液組成的脂立方中，腎上腺素受體-T4溶菌酶融合蛋白與噻嗎洛爾結合物的熱穩定性圖。
具體實施例方式以下進一步描述本發明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進一步地理解本發明，而不構成對其權利的限制。實施例1，一種光譜學測定在脂立方樣品中膜蛋白穩定性的方法，其步驟如下:
(1)表達和純化目標蛋白；在從^1網站上輸入目標膜蛋白名稱搜索序列，得到目標膜蛋白的全長基因序列；將全長序列導入相關細胞表達系統，然后進行純化，得到純化后的膜蛋白溶液；
(2)將膜蛋白溶液混入脂立方樣品；
①將純甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯與下述脂類分子中的一種組成的混合物從-20°C的冰箱取出中，加熱至37-40°C后形成液態；前述脂類分子選自1，2 - 二油酰-sn-甘油-3 -磷酸膽堿，1，2_ 二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺，1，2_ 二油酰-sn-甘油基-3 -磷脂酰甘油，1，2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰絲氨酸或者膽固醇；其中，純甘油一油酸酯占混合物質量的90%以上；
②將液態甘油一油酸酯或者混合物轉移到玻璃針管中冷卻至20-24°C，并立即與膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液樣品，將膜蛋白溶液樣品推過注射器的連接器以形成均勻的脂立方樣品；脂立方樣品中膜蛋 白的最終濃度為0.5-2.0毫克/毫升，脂立方樣品中水的重量百分比為38-42% ;同時以不含前述膜蛋白的緩沖液作對照；
③當一個均勻和透明的脂立方樣品形成后，將50-70微升的脂立方樣品轉移到石英比色皿中，密封；在5600父8和18-22°C的條件下離心；
(3)膜蛋白在脂立方樣品中的穩定性測定；
采集石英比色皿中脂立方樣品的初始吸光度和內在蛋白熒光光譜后，立即對樣品進行升溫，升溫采用5-10°C為一升溫梯度循序進行，每一梯度升溫進行后，需要采用前述方法離心并進行吸光度和內在蛋白熒光光譜采集；升溫的最高溫度不超過100°C;以不含膜蛋白的緩沖液按前述方法進行對照；將采集的吸光度和內在蛋白熒光光譜一起以圖表畫出，即可得到蛋白的退火溫度；退火溫度越高說明膜蛋白溫度性越高，反之亦然；從而實現膜蛋白穩定性的測定。實施例2，實施例1所述的方法，步驟(2)所述的甘油一油酸酯與脂類分子混合物采用以下方法配制:將甘油一油酸酯與所述的脂類分子按比例置于適量的氯仿中，使用氮氣流蒸發大部分溶劑，隨后在真空21-23°C下處理至少12小時，除盡其余的殘留氯仿后，在-20°C下儲存。實施例3:實驗例。1、腎上腺素受體膜蛋白的表達與純化
(1)在NCBI網站上輸入“beta2 adrenergic receptor”搜索序列。根據NCBI網站上公布的序列，得到在真核細胞中編碼腎上腺素受體基因的全長序列。(2)將目標基因轉入昆蟲HEK293細胞表達系統。在塑料培養皿上培養HEK293細胞，在37°C下，在Dulbecco的基礎上修改Eagle培養基(Cellgro)中加入5%的二氧化碳和5%胎牛血清。約48小時后，加入I微克的載體P⑶NA3受體質粒和3微升Fugene6試劑進行轉染。約48小時后，細胞用PBS洗滌，用4%多聚甲醛固定，用PBS +2%山羊血清阻斷，用PBS +2%山羊血清+0.5% NONIDET P-40 (Sigma公司)進行透性化。(3)Dulbecco的基礎上修改Eagle培養基(Cellgro)技術優勢:用吡哆醇代替了鹽酸吡哆醛，而從確保原配方提高了穩定性。Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)是Eagle的基礎培養基(BME)的基礎上提高了 4倍濃度的氨基酸和維生素。原始配方被用來培養小鼠胚胎細胞和已經被修改，以支持各種正常和轉化的細胞，如小鼠和雞細胞的原代培養。該培養基制劑包括葡萄糖，丙酮酸鈉，碳酸氫鈉和L-谷氨酰胺。的DMEM10-013-CV-CM-LB，-LX含有4.5克/升葡萄糖，L-谷氨酰胺，丙酮酸鈉等等。(4)FuGENE 6轉染試劑是一個專有的混合脂類和其他組成成分的試劑。試劑來源于提供的80%乙醇溶液中，無菌過濾，并包裝在玻璃小瓶中。它不包含任何成分的人類或動物組織。(5) PBS 溶液的制備:稱取 8g NaCU0.2g KC1、1.44g Na2HPO4 和 0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸懼水中，用HCl調節溶液的pH值至7.4,最后加蒸懼水定容至I L即可。在15lbf/in2(1034X105Pa)高壓下蒸氣滅菌(至少20分鐘)，保存于室溫或4°C冰箱中。a.當感染的昆蟲細胞超表達目標蛋白后，將細胞收集好，并用低鹽細胞清洗液初步去除雜質。b.低鹽細胞清洗液包括:25毫摩的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.5 ;10毫摩的氯化鎂；20毫摩的氯化鉀。保存于室溫或4°C冰箱中。c.用低鹽細胞清洗液初步去除雜質，再用高鹽細胞清洗液進一步清洗去除雜質。d.高鹽細胞清洗液包括:25毫摩的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.5 ;10毫摩的氯化鎂；20毫摩的氯化鉀和I摩爾的氯化鈉。保存于室溫或4°C冰箱中。e.用高鹽細胞清洗液進一步清洗去除雜質后，重新將細胞懸浮在細胞懸浮液中。f.細胞懸浮溶液包括:25毫摩的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.5 ;10毫摩的氯化鎂；20毫摩的氯化鉀和40%(體積比)的甘油。保存于_80°C冰箱中。g.當細胞被低鹽和高鹽洗液清洗之后，在細胞懸浮液中加入蛋白提取液將蛋白從細胞膜提取到溶液中。h.膜蛋白提取液包括:25毫摩的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.5 ；300毫摩的氯化鈉，0.5% (體積比)的η-十二烷基-β -D-吡喃麥芽糖苷和0.1% (體積比)膽甾醇半琥珀酸酯。保存于4°C冰箱中。1.將目標膜蛋白提取到溶液中之后，將其結合到鈷結合介質上去。然后用膜蛋白清洗液I去除多余的雜質。j.膜蛋白清洗液I包括:25毫摩的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.5 ; 800毫摩的氣化納，0.1% (體積比)的η-十二燒基-β _D_卩比喃麥芽糖昔,0.02% (體積比)膽留醇半琥珀酸酯，5毫摩的咪唑，10毫摩的氯化鎂和8毫摩的三磷酸腺苷。保存于4°C冰箱中。k.將目標膜蛋白提取到溶液中之后，將其結合到鈷結合介質上去。然后用膜蛋白清洗液2去除多余的雜質。1.膜蛋白清洗液2包括:25毫摩的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.5 ; 150毫摩的氯化鈉，0.05% (體積比)的η-十二烷基-β -D-吡喃麥芽糖苷，0.01% (體積比)膽甾醇半琥珀酸酯和5毫摩的咪唑。保存于4°C冰箱中。
m.用膜蛋白清洗液I和2去除多余的雜質后，用膜蛋白洗脫液將蛋白從鈷結合介質上洗脫，重新回到溶液中。η.膜蛋白清洗液2包括:25毫摩的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.5 ; 150毫摩的氯化鈉，0.05% (體積比)的η-十二烷基-β -D-吡喃麥芽糖苷，0.01% (體積比)膽甾醇半琥珀酸酯和200毫摩的咪唑。保存于4°C冰箱中。0.對于所有測量蛋白樣品，都要準備其對照樣品。即無蛋白的緩沖液(含有的蛋白質溶液中的所有的部件相同的部件，除了目標蛋白質)。P.無蛋白的緩沖液:25毫摩的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.5; 150毫摩的氯化鈉，0.05% (體積比)的η-十二烷基-β -D-吡喃麥芽糖苷，0.01% (體積比)膽甾醇半琥珀酸酯和200毫摩的咪唑。保存于4°C冰箱中。本溶液中不含洗脫蛋白，這是和(12)中溶液的區別。2、數據采集
采用“實施具體步驟”中的步驟制備包含膜蛋白的脂立方樣品，并采集吸光度和熒光光
-1'TfeP曰。3、數據分析
在這項研究中，所有的實驗樣品的制備和分析至少設置三個技術重復。蛋白質熱變性的數據適合使用GraphPad棱鏡軟件(加利福尼亞州拉霍亞，玻爾茲曼S型函數)進行分析。F(T) = Fmin + (Fmax-Fmin) / (1+exp ((Tm-/1) /S))
其中F是標準化熒光，T是溫度，Fmin的和Fmax是擬合參數描述過渡之前和之后的熒光，Tm是化退火溫度，S是過渡的斜率。熒光以及溫度和斜率信號是以任意單位表示的，溫度單位為。C表示。實驗結果可以參見下表1-3和圖1-圖2。表I樣品測定的重復性驗證
權利要求
1.一種光譜學測定在脂立方樣品中膜蛋白穩定性的方法，其特征在于，其步驟如下: (1)表達和純化目標蛋白；在從^1網站上輸入目標膜蛋白名稱搜索序列，得到目標膜蛋白的全長基因序列；將全長序列導入相關細胞表達系統，然后進行純化，得到純化后的膜蛋白溶液； (2)將膜蛋白溶液混入脂立方樣品； ①將純甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯與下述脂類分子中的一種組成的混合物從-20°C的冰箱取出中，加熱至37-40°C后形成液態；前述脂類分子選自1，2 - 二油酰-sn-甘油-3 -磷酸膽堿，1，2_ 二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺，1，2_ 二油酰-sn-甘油基-3 -磷脂酰甘油，1，2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰絲氨酸或者膽固醇；其中，純甘油一油酸酯占混合物質量的90%以上； ②將液態甘油一油酸酯或者混合物轉移到玻璃針管中冷卻至20-24°C，并立即與膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液樣品，將膜蛋白溶液樣品推過注射器的連接器以形成均勻的脂立方樣品；脂立方樣品中膜蛋白的最終濃度為0.5-2.0毫克/毫升，脂立方樣品中水的重量百分比為38-42% ;同時以不含前述膜蛋白的緩沖液作對照； ③當一個均勻和透明的脂立方樣品形成后，將50-70微升的脂立方樣品轉移到石英比色皿中，密封；在5600Xg和18-22°C的條件下離心； (3)膜蛋白在脂立方樣品中的穩定性測定； 采集石英比色皿中脂立方樣品的初始吸光度和內在蛋白熒光光譜后，立即對樣品進行升溫，升溫采用5-10°C為一升溫梯度循序進行，每一梯度升溫進行后，需要采用前述方法離心并進行吸光度和內在蛋白熒光光譜采集；升溫的最高溫度不超過100°C;以不含膜蛋白的緩沖液按前述方法進行對照；將采集的吸光度和內在蛋白熒光光譜一起以圖表畫出，即可得到蛋白的退火溫度；退火溫度越高說明膜蛋白溫度性越高，反之亦然；從而實現膜蛋白穩定性的測定。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)所述的甘油一油酸酯與脂類分子混合物采用以下方法配制:將 甘油一油酸酯與所述的脂類分子按比例置于適量的氯仿中，使用氮氣流蒸發大部分溶劑，隨后在真空21-23°C下處理至少12小時，除盡其余的殘留氯仿后，在_20°C下儲存。
全文摘要
本發明是一種光譜學測定在脂立方樣品中膜蛋白穩定性的方法，該方法將純化后的目標蛋白均勻混入脂立方樣品后，對樣品進行一個溫度逐級升高的梯度加熱/冷卻過程。每一步升溫后，水分子會析出脂立方樣品而使樣品變得渾濁，因此重新冷卻樣品并高速離心，使水分子重新進入脂立方，讓樣品變回無色透明狀態。然后通過采集樣品的熒光信號，鑒定目標蛋白的穩定性。本發明方法設計合理，可操作性強，可以實現在脂立方樣品中直接測定蛋白的穩定性，為隨后的晶體和相關研究提供了數據和理論的支持。本發明方法中應用的基因也可以為蛋白已經各類小分子的控制研究提供支持。
文檔編號G01N21/64GK103115885SQ20131003347
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月29日 優先權日2013年1月29日
發明者劉偉, 許恒皓, 尹欣, 盧辰, 高嵩, 程斌 申請人:連云港脂立方生物醫藥研究所有限公司