多隔室脂質納米顆粒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明應當在用于給予活性成分的納米技術的開發的上下文中看出。
[0002] 本發明涉及多隔室脂質納米顆粒（multicompartmentlipidnanoparticles)(在 下文中稱為"微孔體（cellisome) ")，其制備方法以及其作為用于特別地通過注射、口、鼻或 皮膚給予感興趣的分子的載體的用途。
[0003] 在以下說明書中，方括號（[])中的參考文獻是指在本文末尾呈現的參考文獻列 表。
【背景技術】
[0004] 在過去的30年中，已經開發了兩種主要種類的納米尺寸系統，用作感興趣的分子 的載體：聚合物系統和脂質系統。
[0005] 已經顯示這些中的第一種在它們的工業應用方面是相對令人失望的，可能由于毒 性的原因。此外，市場上可獲得的制劑主要是基于脂質，其已經產生兩大載體家族：脂質體 和脂質顆粒（納米乳液（NE)、納米結構的脂質載體（NLC)、固體脂質納米顆粒（SLN))。脂質 體和較小程度上的納米乳液，已經產生了許多化妝品應用和幾個市場上的藥品，同時更近 來開發的納米結構的固體脂質顆粒存在于許多化妝品產品中和藥學部門的臨床試驗中。
[0006] 脂質體定義為，由在它們之間限定水或含水緩沖液的隔室的一個或多個同心脂質 雙層組成的人造結構。脂質體是由單一類型的，或幾種類型的天然或合成的磷脂（組織其 使得極性頭部在一起以生成雙層）制備的。最慣用的制備脂質體的方法是所謂的脂質膜水 合。脂質體被越來越多地開發為水溶性、脂溶性和兩親性活性成分的載體。因而將活性成分 包封在水相或脂質雙層中使得其可以保護所述成分不受酶降解或被免疫系統消除，并且減 少它們在腸胃外給藥時可能的毒性副作用（例如，溶血、血栓性靜脈炎、血液凝固）（Meure etal.,AapsPharmscitech, 9:798-809,2008;StormandCrommelin,Pharmaceutical Science&TechnologyToday, 1:19-31，1998) [1，2]。然而，基于十二種商用組合物（例如， MyocetK、Doxil'/Caelyx"、AmBisomeK、.VisudyneK 等），脂質體具有幾個主要的 缺點：它們缺少對靶細胞的特異性，磷脂的氧化和物理不穩定性需要將它們凍干，它們工業 生產較為易損（theyaredelicatetoproduceindustrially)，并且可以包封的感興趣的 分子的量存在特定限制。實際上，兩親性或親脂性分子能夠通過插入它們的膜與脂質體結 合，但是有后者的不穩定的風險。
[0007] 乳液是一種液體（分散相）的液滴在另一種（分散劑或連續相）中的精細分散 體，這兩種液體是相對不互溶的；它們最通常是水/油類型。術語"納米乳液"（NE)是當獲 得的粒徑非常小，即平均尺寸為約一百納米時使用的。它們通常是通過將在水相中的油相 機械打碎來生產，并且可選地通過面活性劑的存在來穩定。相比常規的乳液，小尺寸的球粒 (globule)賦予它們有利的藥用性質，具體地，在存儲期間的物理穩定性和可能的給藥路徑 (具體地，需要使用小液滴的靜脈給藥）的方面。然而，這些系統僅可以結合可溶于這些乳 液的油類組分（豆油、橄欖油）的非常親脂性的活性成分。因而限制了它們的潛在應用。
[0008] 開發了固體脂質納米顆粒（SLN)和納米結構脂質載體（NLC)以增加包封 的活性成分的物理化學穩定性和脂質載體整體的給藥后穩定性，借助于它們的粘 附、保持（occlusion)和皮膚含水（skinhydration)的性能，通常最終用于化妝 品，以及用于給予和保護感興趣的活性成分的藥物（Bunjes,CurrentOpinionin Colloid&InterfaceScience,16(5):405-411, 2011；Hardeetal. ,ExpertOpinionon DrugDelivery,8(11):1407-1424, 2011；Harmsetal.,JournalofDrugDelivery ScienceandTechnology, 21 (1):89-99, 2011；JoshiandMuller,EuropeanJournal ofPharmaceuticsandBiopharmaceutics, 71:161-172, 2009；Mulleretal. ,Current DrugDiscoverytechnologies, 8(3):207-227, 2011；Pardeikeetal. ,International JournalofPharmaceutics, 366:170-184,2009；SoutoandDoktorovova,Methodsin Enzymology，464:105-129, 2009) [3-9]。如同上述的納米乳液，使用的原材料的非常高 的親脂性限制了潛在的可給予的活性成分的選擇。此外，還顯示固態的脂質的多態性 (polymorphism)對這些系統（排出（expulsion)活性分子、凝膠）的物理穩定性具有大的 影響，特別是SLN的情況。
[0009] 由昂熱大學（UniversityofAngers)開發的脂質納米膠囊是通過相轉化方法 獲得的，并且由磷脂單層圍繞。雖然與SLN和NLC類的納米分散體非常相似，這些顆粒已 經描述為通過磷脂的結晶層和非離子聚氧乙烯表面活性劑穩定的納米膠囊（國際申請W0 01/64328;Huynhetal·，JournalofPharmaceutics, 379:201-209, 2009) [10, 11]。有利 地是由于其是相對"溫和的"，相轉化法需要使用相對特定的原材料以及在準備過程中非常 精細控制溫度。這些方面可以限制這種方式的大規模開發。
[0010] 幾年之前，開發了由雙隔室的油/水結構（稱為"手袋（handbag)"）組成的亞 微米尺度陽離子乳液（圖1)。為了將它們用作活性成分的載體，它們的形成需要十八胺 (stearylamine)的存在，其支持甘油三酯大量插入限定含水隔室的脂質雙層（Texeiraet al·，PharmaceuticalResearch, 17:1329-1332,2000) [12]。令人遺憾地，這些雙隔室物的 比例在制備過程中形成的眾多其他物體（膠束、脂質體、納米乳液）中占少數（小于20% )。 此外，考慮到這類產品對負電荷的生物膜的毒性，應謹慎考慮使用如十八胺的陽離子表面 活性劑。
[0011] 更邊緣地（moremarginal)，開發并設計了具有10-250nm直徑顆粒的納米 乳液（稱為乳液體（emulsome)或超微體（ultrasome))，其包含由如在脂質體中通過 至少一種磷脂雙層圍繞和穩定的液體或固體形式的脂質組成的脂質芯部，用于脂溶性 或水溶性分子的腸胃外、口、直腸、鼻內或局部給藥（美國專利5, 576, 016;Guptaet al.,JournalofDrugTargeting, 15:437-444,2007;GuptaandVyas,Journalof DrugTargeting, 15:206-217, 2007；Kretschmaretal.,Mycoses, 44:281-286, 2001 ； Paliwaletal. ,InternationalJournalofPharmaceutics, 380:181-188, 2009；ffuet al·,JournalofImmunology, 185(6) :3401-3407, 2010) [13-18]。用于制備這些乳液體 的方法在工業規模上應用困難，因為其通常需要使用有機溶劑以及磷脂膜的沉積和再水 合。實際上，這些顆粒主要是通過與用于脂質體的那些非常相似的磷脂膜水合技術獲得， 除了水相含有預形成的脂質納米顆粒外。最終的顆粒是由磷脂雙層中的油滴的"統計限定 (statisticalconfinement)"產生的。因此，該過程事前地（priori)生成的各種物體的群 體（乳液體、脂質體、納米乳液或固體納米顆粒）而沒有結合脂質和磷脂部分。這可以事前 在特定的純化操作（例如離心）過程中或存儲過程中造成系統穩定性問題。
[0012] 因而對于消除這些現有技術的缺陷、缺點和障礙的脂質載體，具體地，對于可以控 制用于大量給予具有廣泛極性的感興趣的分子的脂質載體的長時間穩定性，和可選的，設 想在相同納米物體中共包封親水性和親脂性活性成分的簡單制造方法存在真實需要。
【發明內容】
[0013] 基于他們自己對脂質納米系統的穩定性和毒性的經驗，發明人已經開發了代表上 述那些，即脂質體和脂質顆粒（圖2A-B)之間的混合系統的新型多隔室脂質納米顆粒（或 微孔體（cellisome))，其中脂質基體和含水隔室結合在相同納米尺度的物體中。盡管可應 用工業規模的簡單制備方法（高壓均化），本發明的微孔體的原理新穎性來自它們的多隔 室形態（圖3)。此外，使用的原材料相對便宜，已經由各種藥典承認，并在制藥工業中采用。
[0014] 形態學上，本發明的這些多隔室納米顆粒與乳液體是完全不同的。在后者中，因 為脂質隔室結合在一個或多個磷脂雙層內，它們本身限定了同心的含水隔室，該物體是各 向同性的（由中心開始在所有方向上性能相同）。在本發明的多隔室脂質納米顆粒（微孔 體）的情況下，因為脂質隔室僅部分由含水隔室覆蓋，組織是各向異性的（從中心開始根據 方向，性能不同）。
[0015] 在本發明的微孔體中，脂質芯部可以由脂質混合物組成，所述脂質混合物在室溫 下（25°c)為液體或半固體，并且結合甘油酯和聚乙二醇酯。后一方面在將具有廣泛極性的 活性成分（AP) (AP在甘油酯中親脂，AP在聚乙二醇中更親水）包封在所述納米顆粒內的方 面是非常重要的。
[0016] 此外，不像對于許多藥物載體觀察到的，本發明的微孔體的懸浮液的穩定性延長 至幾十個月，而不需要，例如脂質體的情況下的凍干步驟。本發明的微孔體是由含有磷脂 (例如，Ph〇Sph〇lip〇nK 90G)的表面活性劑的混合物以及包括一些具有大于11的Griffin HLB的"疏水-親水-疏水"類型的非離子表面活性劑的混合物穩定的。這些三序