一種鑒定菊花遠緣雜交胚胎敗育相關蛋白的方法
【專利摘要】本發明公開了一種鑒定菊花遠緣雜交胚胎敗育相關蛋白的方法，屬于菊花育種與蛋白質組學領域。該方法包括：以栽培小菊作母本，野菊菊花腦作父本開展遠緣雜交工作。授粉后不同時間剪下已授粉的花序，分別取形態發育完整、飽滿的子房和形態發育異常、不飽滿的子房，取樣后立即在液氮中速凍后保存于-80℃冰箱中。樣品用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質，保存于-80℃。最后運用iTRAQ與質譜技術快速鑒定差異蛋白，并進行生物信息學分析，獲得與菊花遠緣雜交育種中胚胎敗育的相關蛋白。本發明針對菊花及其近緣屬野生種，提供了一種快速、準確鑒定菊花胚胎發育過程中不同發育階段的不同形態的胚胎差異蛋白，為解決菊花遠緣雜交胚胎敗育提供研究基礎。
【專利說明】一種鑒定菊花遠緣雜交胚胎敗育相關蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及菊花雜交育種與蛋白質組學領域，涉及菊花遠緣雜交后胚胎在不同發育時期正常與敗育胚胎差異蛋白的快速檢測與鑒定方法，具體地說涉及一種鑒定菊花遠緣雜交胚胎敗育相關蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]菊花原產中國，是我國十大傳統名花、世界四大切花和十大盆花之一，在花卉生產中占有十分重要的地位。目前，國內菊花品種高達數千個，但多數觀賞性狀優良的品種各種抗性較差，而多數近緣種屬的野生資源中卻含有許多栽培菊品種所缺乏的優良性狀，為此運用栽培品種與野生資源進行遠緣雜交的方法將是改良菊花抗性的有效途徑。
[0003]然而，已有研究表明，菊花遠緣雜交中經常遇到各種生殖障礙，受精前障礙(pre-fertilization barriers)和受精后障石尋(post-fertilization barriers)是導致菊花遠緣雜交結實率低的主要因素，其中受精后障礙發生更為普遍，即雜交后雖能夠完成受精作用過程，但胚胎發育過程遇到障礙，導致發育停止或者完全壞死，即胚胎敗育，最終引起雜父不結頭。
[0004]目前的研究主要集中在對胚胎發育的形態結構、組織化學等方面，如胚胎敗育發生的時期和胚胎敗育的組織結構特征等，很少從更深層次上開展研究。由于這些形態、組織等方面的變化從根本上說還是由基因和蛋白表達水平上的變化所引起，因此為了能真正弄清胚胎敗育的機理，除了從細胞與結構水平上開展相關的研究外，還需要從分子水平上開展更為深入的研究。控制植物胚胎發育的基因通常高達數千種，直接從基因水平上著手很難找到控制胚胎敗育的相關基因。而在最近10多年興起與逐漸完善的蛋白質組學(proteomics)技術一方面可以同時分辨和鑒定上千個甚至更多的蛋白質，另一方面因為胚胎敗育與蛋白質表達密切相關，因此，蛋白質組學將是研究植物胚胎敗育較為理想的手段，準確、快速地鑒定出正常胚胎與敗育胚胎的關鍵差異蛋白有十分重要的意義。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種鑒定菊花遠緣雜交胚胎敗育相關蛋白的方法。鑒定菊花正常胚胎與敗育胚胎差異蛋白的方法，為克服菊花遠緣雜交受精后障礙研究提供分子基礎，實現不同菊屬間各種優良基因的轉移。
[0006]本發明的目的通過以下技術方案實現:
[0007]—種鑒定菊花遠緣雜交胚胎敗育相關蛋白的方法，包括以下步驟:
[0008]I)以栽培菊花作母本，野菊作父本進行遠緣雜交，分別于授粉后12 d和18 d剪下已授粉的花序進行取樣，授粉后12 d時取發育正常、飽滿的子房，授粉后18 d時分別取發育正常、飽滿的子房及發育異常、不飽滿的子房；取樣后立即在液氮中預處理廣2 h，然后于-80°C貯存；
[0009]2)將步驟I)所取得的樣品分別用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質，得到授粉后12 d發育正常飽滿子房的蛋白質、授粉后18 d發育正常飽滿子房的蛋白質和發育異常不飽滿子房的蛋白質，于_80°C保存；
[0010]3)將授粉后12 d發育正常飽滿子房的蛋白質、授粉后18 d發育正常飽滿子房的蛋白質和發育異常不飽滿子房的蛋白質分別運用iTRAQ與質譜技術快速鑒定差異蛋白，并進行生物信息學分析。
[0011]所述的栽培菊花為‘雨花落英’，所述的野菊為菊花腦。
[0012]所述步驟I)所述遠緣雜交方法為:選定父母本，在母本上選取發育良好的花蕾，在舌狀花剛露色時去雄，即將內輪兩性管狀小花全部去除，同時剪去舌狀花花瓣直到可見柱頭，并嚴格進行套袋，待母本柱頭伸出并開叉呈現銳角和分泌黏液時，于晴天10-15時收集已套袋的父本新鮮花粉，對母本進行授粉，授粉后立刻對母本雌蕊繼續套袋隔離。
[0013]步驟2)中用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質的過程為:取樣品在液氮預冷的研缽中迅速研磨至粉末狀，加入提取液制成混合液，將混合液裝入離心管中，放在冰上并在搖床上振蕩后，在15，000 g，4°C下離心15 min，取上清液，向上清液中加入洗滌液I，充分震蕩混勻，_20°C靜止0.5~1.5h ;然后在15,000 g，4°C下離心15 min，棄上清，向沉淀中加洗滌液II洗滌，-20°C靜止30 min以上，重復用洗滌液II洗滌f 2次后冷凍干燥沉淀，將獲得的蛋白質干粉于_80°C長期保存。
[0014]上述的提取液為:8M尿素、2%硫脲(g/ml, IOOml提取液中含2g硫脲)、1% (v/v)Trition X_100、50 mM NaCl、20 mM Tris, pH =8.0 ;所述的洗滌液 I 為:_20°C預冷丙酮加0.07% DTT (g/ml, IOOml 洗滌液 I 中含 0.07g DTT)和 10% TCA (g/ml, IOOml 洗滌液 I 中含IOg TCA);所述的洗滌液II為:-201:預冷丙酮加0.07% DTT (g/ml，IOOml洗滌液II中含0.07g DTT) ο
[0015]步驟3)中運用iTRAQ 與質譜技術快速鑒定差異蛋白主要包括以下步驟:樣品前處理、第一維高pH反相色譜分離和第二維低pH反相色譜質譜聯用數據采集，在利用生物信息學手段對數據分析基礎上，獲得與胚胎敗育密切相關的蛋白；所述的樣品前處理包括以下步驟:蛋白定量、蛋白純化、蛋白酶解、肽段iTRAQ標記、去除殘留標記試劑、脫鹽。
[0016]所述的第一維高pH反相色譜分離的過程為:將樣品前處理后得到的肽段粉末使用高pH流動相A溶解上樣，使用梯度洗脫，0-30 min，流動相由5%B升至35%B ;30_32 min,由 35%B 升至 80%B ；32-35 min 保持 80%B，35-36 min 由 80%B 降至 5%B，并保持 14 min 平衡色譜柱，高PH反相梯度共50 min;流速為200 μ?/min，色譜柱保持在室溫條件，使用紫外214 nm波長檢測；色譜系統死時間(t0)為2 min,由4 min開始每隔2 min使用EP管收集餾分，最后第32-36 min收集為一管，共計收集15管，分別干燥成肽段粉末；所述的高pH流動相A為20 mM甲酸銨，pH=10.0，色譜純氨水調節pH ;高pH流動相B為20 mM甲酸銨，90%(v/v)乙腈，pH=10.0,色譜純氨水調節pH。
[0017]所述的第二維低pH反相色譜質譜聯用數據采集的過程為:1)將第一維高pH反相色譜分離得到的肽段干粉使用流動相A溶解，溶解后上樣；2)上樣流速為20 μ?/min，上樣5 min,肽段直接被捕集柱捕集；3)經過閥切換,使捕集柱和分析柱相連，同時啟動Nano泵進行RP分離，啟動質譜采集在線檢測肽段；4) 100 min內從5% B升至40% B, 5 min內B從40%升至80%，然后I min內B降至5%，以5%的B平衡色譜柱14 min,反相過程共120min,流速為500 nL/min,色譜柱溫度為35°C;所述的流動相A:5%(v/v)乙腈,0.1%(ν/ν)甲酸水溶液，pH=2.5，色譜純甲酸調節pH ;流動相B:90%(v/v)乙腈，0.1%(ν/ν)甲酸水溶液，pH=2.5，色譜純甲酸調節pH。
[0018]質譜條件:離子源噴霧電壓為1.2 kV，LTQ Orbitrap XL質譜儀加熱毛細管設定為2000C，采用數據依賴模式自動在MS和MS/MS間切換采集，全掃描MS使用Orbitrap進行質心模式掃描，掃描范圍為m/z 400-1800，分辨率設定為30,000 (m/z 400處)，線性離子阱(LTQ)離子最大引入時間為200 ms,自動增益控制(Automatic gain control, AGC)設定為IxlO6,隨后使用高能碰撞解離(Higher energy C-trap dissociation, HCD)對符合串級(MS/MS)碎裂條件的母離子進行碎裂并用orbitrap進行掃描，掃描分辨率設定為7500，掃描范圍根據母離子質荷比自動控制，最低掃描范圍固定為m/z=100處，最高到2000，對強度排名前6的離子進行MS/MS并進行Centroid模式掃描，進行MS/MS的最低離子強度值設定為8000，MS/MS時LTQ離子最大引入時間為800 ms，AGC控制設定為2xl05，母離子選擇窗口設定為3道爾頓，對于單電荷和未知電荷數的離子不進行MS/MS采集，動態排除設定為每個母離子在10 s內進行2次MS/MS，之后排除180 S，排除窗口為母離子質荷比前10 ppm,母離子質荷比后30 ppm, MS/MS使用高純氦氣，40%的碰撞能量，碰撞反應40 ms。
[0019]上述的數據分析過程為:將第二維低pH反相色譜質譜聯用采集的數據使用Protein Pilot軟件的Paragon算法進行肽段、蛋白鑒定和定量，檢索數據庫為NCBI擬南芥和水稻種屬非冗余數據庫，搜索參數設置如下:胰蛋白酶，全酶切方式，最大漏切為2 ;固定修飾為半胱氨酸的methyl methanethiosulfonate (甲基硫代硫磺酸酯,MMTS)烷基化，可變修飾為甲硫氨酸的氧化，肽段N端和賴氨酸的iTRAQ修飾；為降低假陽性結果，蛋白鑒定標準設定為ProtScore≤1.3(此時蛋白置信度≤95%)，同時最少使用2條置信度≤95%的肽段進行蛋白定量；數據結果經過自動偏離校正以便消除標記樣品合并時引入的誤差。
[0020]在上述方法中，步驟I)選擇母本時應選擇生長強健，色澤、花型、姿態等優美的具有較高觀賞價值的栽培菊 ，父本則根據母本需要改良的性狀有針對性地選擇，如選擇各種抗性優良的野菊做父本，可以將野生菊的優良抗性基因轉入到栽培菊花中以提高栽培品種的相應抗性。胚胎取樣方法:在體視顯微鏡下(在體視顯微鏡下從形態上很容易辨別出正常與敗育的胚胎)對不同發育階段的正常與敗育胚胎進行取樣，取樣后立刻在液氮中預處理1-2 h，然后貯存在-80°C條件下用于蛋白質組學和分子生物學研究。
[0021]同重標簽標記的相對和絕對定量(iTRAQ)技術是近年來最新開發的一種新的蛋白質組學定量研究技術，iTRAQ試劑盒包括四種同量的胺活性試劑，能對蛋白質水解的肽段進行標記，因此采用串聯質譜方法，可以對肽段進行精確的鑒別和定量，可對多達4種或8種不同樣本同時進行定量分析，并具有較高的重復性。通過該技術，可以快速鑒定出菊花胚胎發育不同時期的關鍵差異蛋白，為解決菊花遠緣雜交中胚胎敗育問題提供研究基礎。
[0022]本發明方法中所述的室溫為25±5°C。
[0023]本發明的有益效果:
[0024]本發明提供了一種鑒定栽培菊與其近緣屬野生種雜交授粉后一定時期內正常胚胎與敗育胚胎關鍵差異蛋白的方法，具有快速、準確的特點，為解決菊花遠緣雜交受精后胚胎敗育問題提供研究基礎。
【具體實施方式】[0025] 下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0026]本發明所提供的利用iTRAQ技術快速鑒定菊屬與近緣屬遠緣雜交授粉后發育正常的胚胎與敗育胚胎差異蛋白的方法，其具體實施示例如下:
[0027]1.遠緣雜交及取樣
[0028]1.1遠緣雜交
[0029]以栽培小菊‘雨花落英’(2n=6x=54)作母本，選取發育良好的花蕾，在舌狀花剛露色時去雄，即將內輪兩性管狀小花全部去除，同時剪去舌狀花花瓣直到可見柱頭(不傷及柱頭)，并嚴格進行套袋。待母本柱頭伸出并開叉呈現銳角和分泌黏液時(去雄后3-5 d)，于晴天10-15時收集已套袋的父本菊花腦(2η=2χ=18)的新鮮花粉，用毛筆對母本進行授粉，授粉后立刻對母本雌蕊繼續套袋隔離。
[0030]1.2胚胎取樣
[0031]授粉后12 d時，剪下一部分已授粉的花序，用鑷子取下每一朵小花，在體視顯微鏡下取每一朵小花的子房，并去除少部分發育不良的不飽滿子房，最后將發育正常飽滿的子房用錫箔紙包好立即在液氮中預處理1-2 h，然后貯存在-80°C條件下。
[0032]授粉后18 d時，剪下剩余的已授粉花序，用鑷子取下每一朵小花，在體視顯微鏡下能觀察到子房的飽滿程度有差異，并將發育正常飽滿的和發育異常不飽滿的子房分開，分別用錫箔紙包好立即在液氮中預處理1-2 h，然后貯存在-80°C條件下。
[0033] 2.蛋白質提取
[0034]用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質。具體步驟如下:
[0035]2.1溶液配制
[0036]本方法提蛋白所需的三種溶液分別為:
[0037](I)提取液:8 M 尿素、2%(g/ml)硫脲、l%(v/v) Trition X-100,50 mM NaCl、20mM Tris, pH =8.0 ；
[0038](2)洗滌液1:-20°C預冷丙酮加0.07% (g/ml)DTT(中文名:二硫蘇糖醇)和10%(g/ml) TCA (三氯乙酸)；
[0039](3)洗滌液11:-201:預冷丙酮加0.07% (g/ml)DTT0
[0040]注:DTT和TCA都是用的時候臨時加。
[0041]2.2蛋白提取
[0042]I)取0.5 g樣品置于液氮預冷的研缽中，迅速研磨至粉末狀，加入2 ml提取液，然后將研鉢放在冰上。
[0043]2)在提取液開始溶化時將其分裝到2個2 ml的離心管中，然后將離心管橫放在冰上，在搖床上振湯I h。
[0044]3)在15，000 g，4°C下離心15 min，取上清液，向上清液中加入I ml洗滌液I，充分震蕩混勻，_20°C靜止I h左右。
[0045]4)在15，000 g，4°C下離心15 min，棄上清，向沉淀中加洗滌液II，使沉淀懸浮于洗滌液II中，-20°c靜止30 min以上。
[0046]5)重復步驟4) 2次，冷凍干燥沉淀，將獲得的蛋白質干粉_80°C保存。
[0047]依照上述步驟進行蛋白提取，分別得到授粉后12d發育正常飽滿子房的蛋白質、授粉后18d發育正常飽滿子房的蛋白質和發育異常不飽滿子房的蛋白質。[0048]3.快速鑒定差異蛋白，并進行生物信息學分析
[0049]將授粉后12 d發育正常飽滿子房的蛋白質、授粉后18 d發育正常飽滿子房的蛋白質和發育異常不飽滿子房的蛋白質分別運用iTRAQ與質譜技術快速鑒定差異蛋白，并進行生物信息學分析。
[0050]3.1樣品前處理
[0051]3.1.1蛋白定量:
[0052]使用Amersham 2-D Quant Kit (試劑盒)進行定量(GE公司，美國),流程如下:
[0053]I)使用試劑盒提供的2 mg/ml牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA),標準溶液按照下表配制標準曲線。第一管為空白，不包含蛋白。
[0054]
【權利要求】
1.一種鑒定菊花遠緣雜交胚胎敗育相關蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)以栽培菊花作母本，野菊作父本進行遠緣雜交，分別于授粉后12d和18 d剪下已授粉的花序進行取樣，授粉后12 d時取發育正常、飽滿的子房，授粉后18 d時分別取發育正常、飽滿的子房及發育異常、不飽滿的子房；取樣后立即在液氮中預處理廣2 h，然后于-80°C貯存； 2)將步驟I)所取得的樣品分別用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質，得到授粉后12d發育正常飽滿子房的蛋白質、授粉后18 d發育正常飽滿子房的蛋白質和發育異常不飽滿子房的蛋白質，于_80°C保存； 3)將授粉后12d發育正常飽滿子房的蛋白質、授粉后18 d發育正常飽滿子房的蛋白質和發育異常不飽滿子房的蛋白質分別運用iTRAQ與質譜技術快速鑒定差異蛋白，并進行生物信息學分析。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的栽培菊花為‘雨花落英’，所述的野菊為菊花腦。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟I)所述遠緣雜交方法為:選定父母本，在母本上選取發育良好的花蕾，在舌狀花剛露色時去雄，即將內輪兩性管狀小花全部去除，同時剪去舌狀花花瓣直到可見柱頭，并嚴格進行套袋，待母本柱頭伸出并開叉呈現銳角和分泌黏液時，于晴天10-15時收集已套袋的父本新鮮花粉，對母本進行授粉，授粉后立刻對母本雌蕊繼續套袋隔離。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)中用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質的過程為:取樣品在液氮預冷的研缽中迅速研磨至粉末狀，加入提取液制成混合液，將混合液裝入離心管中，放在冰上并在搖床上振蕩后，在15,000 g，4°C下離心15 min，取上清液，向上清液中加入洗滌液I，充分震蕩混勻，_20°C靜止0.5^1.5h ;然后在15，000 g，4°C下離心15 min,棄上清，向沉淀中加洗漆液II洗漆，-20°C靜止30 min以上,重復用洗漆液II洗滌 2次后冷凍干燥沉淀，將獲得的蛋白質干粉于_80°C長期保存。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述的提取液為:8M尿素、2%硫脲、1%Trition X_100、50 mM NaCl,20 mM Tris, pH =8.0 ;所述的洗滌液 I 為:_20°C預冷丙酮加0.07% DTT和10% TCA ;所述的洗滌液II為:_20°C預冷丙酮加0.07% DTT。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟3)中運用iTRAQ與質譜技術快速鑒定差異蛋白主要包括以下步驟:樣品前處理、第一維高PH反相色譜分離和第二維低pH反相色譜質譜聯用數據采集，在利用生物信息學手段對數據分析基礎上，獲得與胚胎敗育密切相關的蛋白；所述的樣品前處理包括以下步驟:蛋白定量、蛋白純化、蛋白酶解、肽段iTRAQ標記、去除殘留標記試劑、脫鹽。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的第一維高pH反相色譜分離的過程為:將樣品前處理后得到的肽段粉末使用高PH流動相A溶解上樣，使用梯度洗脫，0-30min,流動相由 5%B 升至 35%B ;30_32 min,由 35%B 升至 80%B ;32_35 min 保持 80%B，35-36min由80%B降至5%B，并保持14 min平衡色譜柱，高pH反相梯度共50 min ;流速為200 μ?/min，色譜柱保持在室溫條件，使用紫外214 nm波長檢測；色譜系統死時間(t0)為2 min,由4 min開始每隔2 min使用EP管收集懼分,最后第32-36 min收集為一管,共計收集15管，分別干燥成肽段粉末；所述的高PH流動相A為20 mM甲酸銨，pH=10.0，色譜純氨水調節pH ;高pH流動相B為20 mM甲酸銨,90%乙腈，pH=10.0,色譜純氨水調節pH。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的第二維低pH反相色譜質譜聯用數據采集的過程為:I)將第一維高PH反相色譜分離得到的肽段干粉使用流動相A溶解，溶解后上樣；2)上樣流速為20 μ?/min，上樣5 min，肽段直接被捕集柱捕集；3)經過閥切換，使捕集柱和分析柱相連，同時啟動Nano泵進行RP分離，啟動質譜采集在線檢測肽段；4) 100min內從5% B升至40% B, 5 min內B從40%升至80%，然后I min內B降至5%，以5%的B平衡色譜柱14 min，反相過程共120 min，流速為500 nL/min，色譜柱溫度為35°C ;所述的流動相A:5%乙腈，0.1%甲酸水溶液，pH=2.5，色譜純甲酸調節pH ;流動相B:90%乙腈，0.1%甲酸水溶液，pH=2.5,色譜純甲酸調節pH。 質譜條件:離子源噴霧電壓為1.2 kV，LTQ Orbitrap XL質譜儀加熱毛細管設定為200°C，采用數據依賴模式自動在MS和MS/MS間切換采集，全掃描MS使用Orbitrap進行質心模式掃描，掃描范圍為m/z 400-1800，分辨率設定為30，000 (m/z 400處)，線性離子講(LTQ)離子最大引入時間為200 ms,自動增益控制設定為IxlO6,隨后使用高能碰撞解離對符合串級(MS/MS)碎裂條件的母離子進行碎裂并用orbitrap進行掃描，掃描分辨率設定為7500，掃描范圍根據母離子質荷比自動控制，最低掃描范圍固定為m/z=100處，最高到2000，對強度排名前6的離子進行MS/MS并進行CentiOid模式掃描，進行MS/MS的最低離子強度值設定為8000，MS/MS時LTQ離子最大引入時間為800 ms,自動增益控制設定為2xl05，母離子選擇窗口設定為3道爾頓，對于單電荷和未知電荷數的離子不進行MS/MS采集，動態排除設定為每個母離子在10 s內進行2次MS/MS，之后排除180 S，排除窗口為母離子質荷比前10 ppm，母離子質荷比后30 ppm, MS/MS使用高純氦氣，40%的碰撞能量，碰撞反應40ms 。
9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的數據分析過程為:將第二維低pH反相色譜質譜聯用采集的數據使用Protein Pilot軟件的Paragon算法進行肽段、蛋白鑒定和定量，檢索數據庫為NCBI擬南芥和水稻種屬非冗余數據庫，搜索參數設置如下:胰蛋白酶，全酶切方式，最大漏切為2 ;固定修飾為半胱氨酸的甲基硫代硫磺酸酯烷基化，可變修飾為甲硫氨酸的氧化，肽段N端和 賴氨酸的iTRAQ修飾；為降低假陽性結果，蛋白鑒定標準設定為ProtScore≤1.3 (此時蛋白置信度≤95%)，同時最少使用2條置信度≤95%的肽段進行蛋白定量；數據結果經過自動偏離校正以便消除標記樣品合并時引入的誤差。
【文檔編號】G01N30/89GK103472182SQ201310385454
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月29日 優先權日:2013年8月29日
【發明者】滕年軍, 張鳳姣, 黃至喆, 陳發棣, 房偉民, 蔣甲福, 管志勇, 陳素梅, 劉兆磊 申請人:南京農業大學