專利名稱：檢測小麥遠緣雜交雜種中x型hmw-gs基因的方法
技術領域：
本發明涉及分子遺傳學領域，特別是涉及檢測沙融山羊草X型高分子量谷蛋白亞基(high molecular weight glutenin subunit, HMW-GS)基因的引物,本發明還涉及利用該引物進行小麥遠緣雜交雜種及后代中X型谷蛋白亞基基因檢測的方法及檢測試劑盒。
背景技術：
小麥的野生近緣種中具有許多普通小麥基因庫中所欠缺的優良基因資源，是可供利用的寶貴資源庫。到目前為止，人們通過染色體工程技術已將黑麥、簇毛麥、中間偃麥草、披堿草、高大山羊草、大麥等近緣種質的有益基因導入小麥。如山羊草屬物種具有抗條銹、葉銹、桿銹病、白粉病，耐旱、耐鹽堿、耐寒、高蛋白等對小麥改良十分重要的優良基因，是小麥改良的外源基因供體。因此，通過遠緣雜交把小麥的野生近緣種有利基因導入普通小麥，進而改變小麥的遺傳背景，豐富小麥遺傳資源具有重要意義。小麥改良是通過對目標基因進行選擇，實現優良基因集成的過程。如果在目標基因導入小麥的過程中，對被轉移的基因及其載體一外源染色體或染色體片段進行有效、快速的鑒定和追蹤，可以提高選擇的準確性，從而縮短育種周期，提高育種效率。因此，對導入小麥的外源染色體、染色體片段或所攜帶的外源基因進行有效鑒定(即真雜種的鑒定)十分重要。目前，基于遺傳標記系統而建立起來的鑒定外源染色體的常用方法，主要包括:形態學鑒定和細胞學 鑒定等。形態學分析通過比較觀察雜種Fl植株與親本在形態學上的異同而做出鑒定；細胞學鑒定通過核型分析，染色體配對分析，C-帶技術等對雜種Fl進行鑒別；此外，原位雜交技術也被廣泛用于外源染色體或片段的鑒定，原位雜交通過將放射性或非放射性標記的外源核酸(探針)與染色體或DNA上經過變性后的單鏈DNA互補配對，結合成專一性的核酸分子，在經一定的檢測手段將待測核酸在染色體或DNA上的位置顯示出來，從而進行染色體的識別與雜種的鑒定。然而，無論是形態學鑒定，細胞學鑒定還是原位雜交都必須通過培育Fl代種子成植株，并在其合適的生長時期取材才能做分析與鑒定，形態學鑒定更是需要觀察Fl植株與其親本的整個生長周期并作相應的比較。這些鑒定方法對季節與取材時間要求嚴格且部分操作復雜，對操作、技術及實踐經驗要求高，鑒定時間跨度大，不能當年進行鑒定。高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)是小麥胚乳中的重要貯藏蛋白，占小麥總儲藏蛋白的10%左右，是小麥面粉加工品質的重要決定因素。在普通小麥及其近緣物種中，高分子量谷蛋白亞基由位于第I部分同源群染色體長臂的單個個基因位點所控制，每一個HMW-GS基因位點上都包含2個緊密連鎖的基因，其中分子量較大的稱為X型亞基，分子量較小的稱為Y型亞基。小麥近緣種野生中，編碼HMW-GS的位點也位于第一同源群染色體長臂上，高分子量谷蛋白亞基的類型和組成的不同決定了小麥面粉的加工品質的優和劣。已有的研究表明，普通小麥本身含有的HMW-GS的類型較少，而在小麥近緣屬物種中含有大量新的HMW-GS變異類型。沙融山羊草是小麥的近緣物種之一，具有許多優良的抗病、抗逆及品質基因，并被用來作為親本通過遠緣雜交的方式對普通小麥進行遺傳改良。從沙融山羊草中克隆鑒定出的新的高分子量谷蛋白X型亞基基因，其編碼的高分子量谷蛋白亞基大小幾乎超過了所有已知的其他HMW-GS，是非常獨特的等位基因變異類型，而高分子量谷蛋白亞基大小與組成直接影響小麥的加工品質，因此，沙融山羊草中如此大的亞基轉移進普通小麥，必將對普通小麥的品質產生影響，而且，以檢測該亞基基因的存在作為判斷雜交成功的標志，將比其他性狀更加直觀，容易檢測鑒定。因此，在連續雜交育種的過程中有必要建立一種簡單、高效、快速的檢測沙融山羊草與其他小麥族物種遠緣雜交雜種中屬于沙融山羊草X型谷蛋白亞基基因的方法，但是，形態學與細胞學的觀察鑒定方法，操作繁瑣、評價標準不易準確把握，不能快速對外源轉入的目的基因進行追蹤與鑒定，據此，我們依據已知的沙融山羊草高分子量X型谷蛋白亞基基因序列，開發了特異性引物，不但擴增篩選鑒定出了以沙融山羊草為親本的不同雜交及回交后代材料中屬于沙融山羊草X型亞基的編碼基因條帶，而且能在連續的雜交世代中追蹤檢測沙融山羊草X型谷蛋白亞基基因的轉移情況，這不但減少了雜交育種的工作量，而且結果可靠，將極大的促進對遠緣雜交后代的研究工作而加快品質育種的進程。
發明內容
本發明的第一個目的在于提供用于檢測沙融山羊草X型HMW-GS基因的引物。本發明的第二個目的在于提供通過檢測沙融山羊草X型HMW-GS基因的引物，鑒定小麥遠緣雜交雜種中是否有沙融山羊草X型谷蛋白亞基基因的方法，加快小麥品種的選擇進度。本發明的第三個目的在于提供檢測小麥遠緣雜交雜種中X型HMW-GS基因的試劑
盒。 基于以上目的，本發明根據Jiang et al.(BMC plant biology2012,12:73)對沙融山羊草的研究結果，從NCBI數據庫中獲得沙融山羊草高分子量X型谷蛋白亞基完整的編碼基因，并對基因序列結構進行分析。運用DNAMAN軟件對沙融山羊草X型谷蛋白亞基編碼基因及二粒小麥，普通小麥的HMW-GS基因進行序列比對分析，分析沙融山羊草HMW-GS基因序列的特異性位點，篩選確定沙融山羊草高分子量X型高分子量谷蛋白亞基編碼基因序列12-32bp，429-447bp，處為該基因的特異性位點，據此，設計了一對檢測沙融山羊草X型HMW-GS基因的特異性引物。本發明提供了檢測小麥遠緣雜交雜種中沙融山羊草X型HMW-GS基因的引物，是RXl上游引物序列，5’-GTTAGTCCTCTTTGTAGCGA-3’(SEQ IDN0.1)下游引物序列，5’-ATATCCTTGTTGTCTTTGTCCT-3’(SEQIDN0.2)。進一步地，提供了上述引物在檢測小麥遠緣雜交雜種中沙融山羊草X型HMW-GS基因的應用。進一步地，提供了上述引物在小麥雜交鑒定中的應用。進一步地，提供了上述引物在小麥選育中的應用。本發明提供了一種檢測小麥遠緣雜交雜種中X型HMW-GS基因的方法，用引物RXl進行PCR方法擴增待檢小麥基因組DNA，如果用引物RXl能夠擴增出439bp的擴增片段，則標志著該待檢小麥存在X型谷蛋白亞基基因，所述RXl引物的核苷酸序列如SEQ IDN0.Γ2所示。其中，所述PCR方法的反應程序為:預變性94 96°C，5 8min ;94 96°C變性45 60s，60 63°C退火30 40s，72 74°C延伸40 50s，共30 35個循環；終延伸72 74°C 8 lOmin。優選地，所述PCR方法的反應程序為:預變性94°C，5min ;94°C變性45s，60°C退火30s，72。。延伸40s，共30個循環；終延伸72°C 8min。 本發明提供了上述方法在小麥育種中的應用。本發明還提供了一種檢測小麥遠緣雜交雜種中沙融山羊草X型谷蛋白亞基基因的試劑盒，含有引物RXl，上游引物序列，5，-GTTAGTCCTCTTTGTAGCGA-3’下游引物序列，5’-ATATCCTTGTTGTCTTTGTCCT-3’；本發明開發的沙融山羊草高分子量X型谷蛋白亞基基因的特異性引物，直接對雜交后代材料進行目的基因的擴增檢測，不但能從基因分子水平上對雜交后代的真假做出確認鑒定，而且在連續的自交與回交育種過程中能夠追蹤檢測基因的轉移與存在，彌補了形態學鑒定的粗放，細胞學鑒定的繁瑣等不足，并且鑒定方法簡單，結果可靠，這對以通過遠緣雜交育種來改良普通小麥的育種方式來說將是一種很好的輔助育種手段。經過本發明的方法鑒定后，將使后面對雜種的研究能夠更有目的性與針對性，并且隨著對沙融山羊草的繼續深入研究，其 各種優良性狀被用來改良小麥族其他作物，，本發明的以沙融山羊草X型亞基基因為標記基因的分子鑒定，標記方法將能夠推廣到沙融山羊草與所有小麥族物種的雜交后代真假鑒定中，并將極大地方便雜交育種工作，實現作物的遺傳改良。
圖1為四倍體小麥(Z636)與二倍體沙融山羊草(R7)雜交所得種子SDS-PAGE電泳檢測圖，檢測結果發現一個為真雜種一個為假雜種，箭頭表示沙融山羊草中的X型高分子
量谷蛋白亞基。圖2為經檢測為真雜種的Fl (Z636XR7)與其親本的植株生長對比圖。圖3為經檢測為真雜種的Fl (Z636XR7)與其親本的穗形對比圖。圖4為經檢測為真雜種的Fl (Z636XR7)與其親本的穗形對比圖。圖5為遠緣雜交組合Z636XR7后代Fl與普通小麥csph2a回交后代(BCl)SDS-PAGE電泳檢測圖，數字代表所獲得BClFl代種子編號，箭頭表示沙融山羊草中的X型高分子量谷蛋白亞基。圖6為利用RXl引物對雜交后代進行基因特異性擴增的檢測圖，其中，M2為DNAmarker II，父本R7為沙融山羊草，FU BCU F2及相應數字分別代表雜交子一代，回交子一代，Fl自交后代所得種子編號，母本I (早I)為四倍體小麥Z636，母本2 (早2)為回交輪回親本六倍體小麥川農16。圖7為引物RXl分別檢測遠緣雜交Fl，F2，BCl擴增片段克隆測序的序列比對圖。JNOO1485為沙融山羊草中X型高分子量谷蛋白亞基基因在GenBank的登錄號，R7為沙融山羊草的擴增片段序列，F1-1，F1-3，F1_4為R7與Z636雜交Fl代植株的擴增片段序列，F2-1和F2-2是自交F2代植株的擴增片段序列，BCl-1，BC1-4為回交Fl代植株的擴增片段序列，RXlF為上游引物，RXlR為下游引物。圖8為對RXl引物對進行特異性驗證的檢驗圖，其中，M2為DNA marker II，R7為沙融山羊草，F1、F2、BC1分別代表雜交第一代、Fl自交后代、Fl回交一代；編號1_5分別代表5個四倍體小麥:2636、2606、2639、爪-11-48、524，編號6-12分別代表7個普通小麥:川農16、良麥2號、良麥4號、綿麥37、蜀麥482、川育12、中國春。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。本發明使用的四倍體小麥Z636，六倍體小麥csph2a、川農16，沙融山羊草R7，均可從四川農業大學小麥研究所得到。本發明所用生化試劑均為市售。本發明各試劑配方如下:蛋白提取緩沖液配方為:62.5mM Tris-HCL pH6.8,2% (ff/V) SDS,10% (V/V)甘油，1.5% (ff/V)DTT,0.002%(ff/V)溴酚藍。染色液配方為:0.001%考馬斯亮藍R-250 (W/V)，10%冰醋酸，25%異丙醇；脫色液配方為:10%冰醋酸，25%異丙醇。凝膠制備方法為:采用不連續緩沖系統，分離膠用10%SDS_PAGE (pH8.9)，濃縮膠用 3%SDS-PAGE (pH6.8)；聚丙烯酰胺凝膠配方:
權利要求
1.檢測沙融山羊草X型HMW-GS基因的引物，其特征在于，其為RX1， 上游引物序列，5，-GTTAGTCCTCTTTGTAGCGA-3 ’ 下游引物序列，5’ -ATATCCTTGTTGTCTTTGTCCT-3’。
2.權利要求1所述弓I物在檢測小麥遠緣雜交雜種中沙融山羊X型HMW-GS基因的應用。
3.權利要求1所述引物在小麥雜交鑒定中的應用。
4.權利要求1所述引物在小麥選育中的應用。
5.一種檢測小麥遠緣雜交雜種中沙融山羊草X型HMW-GS基因的方法，其特征在于，用引物RXl進行PCR方法擴增待檢小麥基因組DNA，如果用引物RXl能夠擴增出439bp的擴增片段，則標志著該待檢小麥存在X型HMW-GS基因，所述RXl引物的核苷酸序列如SEQ IDN0.1 2所示。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR方法的反應程序為:預變性94 96°C，5 8min ;94 96°C變性 45 60s，60 63°C退火 30 40s，72 74°C延伸 40 50s，共 30 35個循環；終延伸72 74°C 8 lOmin。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR方法的反應程序為:預變性94°C，5min ;94°C變性 45s，60°C退火 30s，72。。延伸 40s，共 30 個循環；終延伸 72V 8min。
8.權利要求5 7任一所述的方法在小麥育種中的應用。
9.一種檢測小麥遠緣雜交雜種中X型HMW-GS基因的試劑盒，其特征在于，含有引物RXl，上游引物序列，5，-GTTAGTCCTCTTTGTAGCGA-3 ’ 下游引物序列，5’ -ATATCCTTGTTGTCTTTGTCCT-3’。
全文摘要
本發明提供了一種檢測小麥遠緣雜交雜種中沙融山羊草X型高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)基因的方法，本發明還提供了檢測沙融山羊草X型HMW-GS基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，利用該引物進行PCR反應能夠快速準確地檢測小麥遠緣雜交雜種中是否含有沙融山羊草X型HMW-GS基因位點。本方法能夠準確檢測出小麥雜種中沙融山羊草X型HMW-GS基因的轉移與存在，方便跟蹤該基因，大大提高育種工作效率，加快小麥品質育種的進程，在小麥族的雜交育種領域具有良好的應用前景。
文檔編號C12N15/11GK103114134SQ201310025470
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月21日 優先權日2013年1月21日
發明者江千濤, 鄭有良, 趙全志, 魏育明, 趙珊, 馬建, 蒲至恩 申請人:四川農業大學