一種家畜血液中布地奈德異構體的定量檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種家畜血液中糖皮質激素的檢測方法。是一種家畜血液中布地奈德異構體的定量檢測方法。先將色譜甲醇中加入純度為100％的布地奈德異構體和白術內酯III，均勻混合后成對照品，布地奈德在對照品中的濃度R(+)為0.052～10.4μg/mL，S(-)為0.047～9.4μg/mL，白術內酯III在對照品中的濃度為8～12μg/mL。然后在干燥帶塞離心管中加入作為內標物的白術內酯III甲醇溶液0.2mL，吹干離心管，將待測家畜血清0.2mL加入吹干后的離心管中，白術內酯III在甲醇溶液中的濃度等于白術內酯III在對照品中的濃度。用測定的結果可根據公式計算出血清中布地奈德含量。本發明可為人類的健康起到保障作用。
【專利說明】一種家畜血液中布地奈德異構體的定量檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種家畜血液中糖皮質激素一布地奈德異構體的定量檢測方法。
【背景技術】
[0002]布地奈德(Budesonide)為一種糖皮質激素類藥物，臨床研究發現布地奈德主要應用于呼吸系統疾病的治療，效果確切。布地奈德跟硫酸特布他林聯合治療毛細支氣管炎療效顯著；同時布地奈德與沙丁胺醇聯合應用霧化吸入治療慢性阻塞性肺病(COPD)較單一用藥療效確切，可明顯提高患者生活質量。布地奈德與西替利嗪、氟美松可以早期干預支原體肺炎咳嗽癥狀。布地奈德霧化吸入對兒童咳嗽變異性哮喘具有明顯的療效。 [0003]糖皮質激素類藥物也是目前獸醫臨床中應用最廣泛的藥物之一，為獸醫臨床上最有效的抗炎藥物。不少基層獸醫在日常的診療工作中積累了豐富的經驗，形成了各自的用藥體系。然而，由于各種原因，糖皮質激素藥物正出現嚴重濫用的現象。據統計我國剛進入21世紀時糖皮質激素藥物原料生產總量為150噸左右，其中地塞米松產量不到20噸，超過50 %用于出口。之后每年以超過前一年10 %的速度遞增，至2007年受全國范圍暴發高致病性藍耳病的影響，全年產量一度達到300噸，其中以地塞米松產量增長最快，然而據我國農業部2008年公告，每年獸用地塞米松有很大一部分是不合理的濫用。盲目濫用此類藥物引起藥物殘留，不僅對畜禽機體造成很大的傷害，還可以通過環境或食物鏈遷移，最終可能損害人類的自身健康。
[0004]糖皮質激素外用可降低毛細血管的通透性，減少滲出和細胞浸潤，具有抗炎、抗過敏、抗休克、免疫抑制等多種作用，臨床應用廣泛。但長期接觸糖皮質激素易導致皮膚變薄、發紅、發癢，出現血糖升高、高血壓、骨質疏松、胎兒畸形、免疫功能下降等副作用。短時間使用含糖皮質激素的化妝品可抑制皮膚發炎，恢復皮膚彈性，減少皺紋或治療粉刺，促進毛發生長；但長期使用含有糖皮質激素的化妝品就可導致各種副作用，產生激素依賴性，甚至可導致癌癥。近年來糖皮質激素藥物濫用的現象越來越嚴重，引起的公共衛生事件使人們越來越意識到糖皮質激素藥物濫用的危害性。濫用糖皮質激素藥物不僅嚴重影響我國畜牧養殖業的發展，也對人類自身健康構成了威脅。因此我們應該采取有效措施減少糖皮質激素藥物在我國畜牧養殖產業上的濫用，保證我國養殖業持續健康發展，提高生產經濟效益，維護人類自身的生命安全。
[0005]現有的檢測布地奈德的方法------高效液相色譜法，其具有測試結果準確的特
點；可是其存在著以下不足之處:
[0006]1.檢測基質(原料藥或制劑基質)較干凈，雜質少，易于分離；而本研究為生物樣品——動物血液中布地奈德檢測,基質復雜。
[0007]2.流動相選用較復雜，酸性較強，對色譜柱不利。
[0008]3.大多采用外標法定量，難以保證檢測方法的準確性；而本研究內標物選擇較適中。
【發明內容】
[0009]本發明要解決的技術問題是提供一種家畜血液中布地奈德異構體的定量檢測方法，采用該方法檢測布地奈德異構體具有準確性高的優點。
[0010]為了解決上述技術問題，本發明提供一種家畜血液中布地奈德異構體的定量檢測方法，包括以下步驟:
[0011]I)、在色譜甲醇中加入純度為100%的布地奈德異構體和白術內酯III，均勻混合后成對照品；布地奈德在對照品中的濃度R(+)為0.052?10.4μ g/mL，S(-)為0.047?9.4 μ g/mL,白術內酯III在對照品中的濃度為8?12 μ g/mL ；
[0012]2)、在干燥帶塞離心管中加入作為內標物的白術內酯III甲醇溶液0.2mL，吹干離心管，然后將待測家畜血清0.2mL加入吹干后的離心管中；白術內酯III在甲醇溶液中的濃度等于白術內酯III在對照品中的濃度；
[0013]3)、在上述步驟2)所得的離心管中加入4.5?5.5mL的提取試劑；
[0014]4)、將步驟3)所得的離心管振蕩混勻后以4000?10000r/min進行離心，獲取全部有機相；并對所獲取的有機相進行干燥處理；
[0015]5)、將上述干燥處理后的有機相溶解于體積比=40:60的乙腈與水組成的0.2mL流動相中，15000?30000r/min離心后,獲取液體層；
[0016]6)、將步驟I)所得的對照品和步驟5)所得的液體層分別進行高效液相色譜分析，檢測條件如下:以體積比=40:60的乙腈與水作為流動相,流速0.5?1.0mL/min、進樣量10?20 μ L、檢測波長為240nm、色譜柱溫度為30攝氏度；分別獲得對照品以及液體層中布地奈德異構體與白術內酯III的吸收峰面積比；
[0017]7)、根據以下計算公式獲得待測動物血清中布地奈德異構體的含量:
[0018]待測動物血清中布地奈德R(+)的含量=液體層中布地奈德R(+)與白術內酯III的吸收峰面積比X布地奈德R(+)在對照品中的濃度/對照品中布地奈德R(+)與白術內酯III的吸收峰面積比。
[0019]待測動物血清中布地奈德S(_)的含量=液體層中布地奈德S(_)與白術內酯III的吸收峰面積比X布地奈德s(-)在對照品中的濃度/對照品中布地奈德s(-)與白術內酯III的吸收峰面積比。
[0020]作為本發明的動物血清中布地奈德異構體的同時定量檢測方法的改進:步驟3)中的提取試劑為乙酸乙酯。
[0021]作為本發明的動物血清中布地奈德異構體的定量檢測方法的進一步改進:步驟2)中于40?50°C水浴中氮氣流吹干離心管。
[0022]作為本發明的動物血清中布地奈德異構體的定量檢測方法的進一步改進:步驟4)中離心后，去除液體層；然后于40?50°C水浴中氮氣流吹干離心管，得干燥處理后的有機相。
[0023]作為本發明的動物血清中布地奈德異構體的定量檢測方法的進一步改進:步驟I)中白術內酯III在對照品中的濃度為10μ g/mL，步驟3)中加入5mL的乙酸乙酯。
[0024]當待檢動物血清時，采用本發明的方法能得知每mL待檢血清中含有多少Ug的布地奈德異構體。本發明的動物血清中布地奈德異構體的定量檢測方法，采用了高效液相色譜(HPLC)方法，因此能使檢測限達到微克級，完全能夠滿足動物血液中的激素的檢測要求。而且高效液相色譜(HPLC)方法具有分離和分析定量的功能，能夠將血清中激素色譜峰和雜質干擾峰分離開，進行定量分析，能避免了血清中的雜質對檢測結果的干擾，從而確保了檢測結果的正確性。
[0025]為了證明本發明方法的正確性，發明人做了如下的對比實驗:
[0026]選用一種已經確定不含布地奈德的動物血清，其色譜圖如圖2所示(色譜分析檢測條件同本發明)。在該種化妝品中加入不同重量的布地奈德異構體，從而形成含有不同濃度布地奈德的待測樣品。對上述待測樣品分別用本發明的方法和分光光度計方法進行檢測；結果如表1所述:
[0027]表1
[0028]
【權利要求】
1.一種家畜血液中布地奈德異構體的定量檢測方法，其特征在于:在檢測時，首先在色譜甲醇中加入純度為100%的布地奈德異構體和白術內酯III，均勻混合后成對照品；布地奈德在對照品中的濃度R(+)為0.052?10.4μ g/mL，S(_)為0.047?9.4μ g/mL，白術內酯III在對照品中的濃度為8?12 μ g/mL，然后在干燥帶塞離心管中加入作為內標物的白術內酯III甲醇溶液0.2mL，吹干離心管，然后將待測家畜血清0.2mL加入吹干后的離心管中；白術內酯III在甲醇溶液中的濃度等于白術內酯III在對照品中的濃度。
2.如權利要求1所述的一種家畜血液中布地奈德異構體的定量檢測方法，其特征在于:所說的離心管中加入4.5?5.5mL的提取試劑，對所得的離心管振蕩混勻后以4000?10000r/min進行離心，獲取全部有機相，并對所獲取的有機相進行干燥處理。
3.權利如要求2所述的一種家畜血液中布地奈德異構體的定量檢測方法，其特征在于:將干燥處理后的有機相溶解于體積比=40:60的乙腈與水組成的0.2mL流動相中，15000?30000r/min離心后，獲取液體層。
4.如權利要求1或3所述的一種家畜血液中布地奈德異構體的定量檢測方法，其特征在于:將獲取的液體層和對照品的液體分別進行高效液相色譜分析，檢測條件如下:以體積比=40:60的乙腈與水作為流動相，流速0.5?1.0mL/min、進樣量10?20 μ L、檢測波長為240nm、色譜柱溫度為30攝氏度，分別獲得對照品以及液體層中布地奈德異構體與白術內酯III的吸收峰面積比。
5.如權利要求1所述的一種家畜血液中布地奈德異構體的定量檢測方法，其特征在于:根據以下計算公式獲得待測動物血清中布地奈德異構體的含量，待測動物血清中布地奈德R(+)的含量=液體層中布地奈德R(+)與白術內酯III的吸收峰面積比X布地奈德R(+)在對照品中的濃度/對照品中布地奈德R(+)與白術內酯III的吸收峰面積比，待測動物血清中布地奈德S(-)的含量=液體層中布地奈德S(-)與白術內酯III的吸收峰面積比X布地奈德S(-)在對照品中的濃度/對照品中布地奈德S(-)與白術內酯III的吸收峰面積比。
【文檔編號】G01N30/02GK103616442SQ201310524887
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月31日 優先權日:2013年10月31日
【發明者】徐愛春, 張雪梅, 葛建 申請人:中國計量學院