大鼠脊髓角神經元鈣濃度測定方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥檢測領域，具體涉及一種大鼠脊髓角神經元鈣濃度測定方法。
【背景技術】
[0002]糖皮質激素(glucocorticoid，GC)具有廣泛的生理作用，調節機體的多種功能。臨床常用于抗炎、抑制免疫反應和膜穩定等。GC通過基因組和非基因組兩種途徑發揮作用，其中，非基因組作用是近30年來才被慢慢認識并重視的，其效應發生迅速，不涉及基因表達和蛋白質合成，但其分子機制尚不明確。
[0003]近期研究表明，GC在傷害性信息的傳遞及病理性疼痛的發生中充當著重要的角色。文獻資料顯示，GC在疼痛的外周和中樞神經機制中均參與傷害性信息的調制。背根節神經元是感覺傳入的第一級神經元，GC可通過基因組和非基因組兩條途徑改變初級感覺神經元的興奮性，從而調節傷害性信息的產生傳導。GC在疼痛中樞機制的研究主要集中于脊髓水平，脊髓背角感覺神經元上糖皮質激素受體(glucocorticoid reccptor，GR)可通過調節谷氨酸受體等與疼痛密切相關的神經活性物質受體的功能，增強脊髓背角神經元的興奮性，從而促成病理性疼痛的產生與發展，這些效應發生慢，為基因組作用。GC能否通過非基因組作用途徑快速影響脊髓背角神經元的興奮性，繼而影響傷害性信息的傳遞，尚不明確。作為重要的胞內信使，Ca2+對神經元的多種生理功能如興奮性、突觸傳遞以及神經元的發育分化、修復再生等產生決定性影響。GC能否通過調節脊髓背角神經元Ca2+濃度而影響其功能，尚有待實驗證明。
【發明內容】
[0004]本發明的目的之一是為提供一種大鼠脊髓角神經元鈣濃度測定方法，通過該方法可以觀察皮質酮對培養的脊髓背角神經元Ca2+濃度的影響。
[0005]本發明提供一種大鼠脊髓角神經元鈣濃度測定方法，包括以下步驟:
[0006]取出生未滿三日的SD乳鼠，經75%乙醇消毒后斷頭處死，取出脊髓，分離出脊髓背角組織，剝除脊髓外膜，將所述脊髓背角組織剪成小塊，轉移至離心管中，加入胰蛋白酶置于細胞培養箱內消化；然后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基終止其消化；吹打成細胞懸液，離心后棄上清液；加入NB/B27培養基重懸細胞，接種于激光共聚焦專用皿中，培養箱內靜置3h ;加入1.5ml含青霉素和鏈霉素的NB/B27培養基；以熒光指示劑負載，置于培養箱內孵育，NB培養基漂洗，再以NB培養基覆蓋細胞，激光掃描共聚焦顯微鏡掃描檢測。
[0007]進一步的，所述脊髓背角組織剪成Imm3小塊。
[0008]進一步的，所述胰蛋白酶濃度為0.125%。
[0009]進一步的，所述細胞培養箱內消化條件為37°C、5% CO2,消化30min。
[0010]進一步的，所述離心條件為1000r/min離心5min。
[0011]進一步的，所述重懸細胞時NB/B27培養基加入量為200 μ I。
[0012]進一步的，接種的所述激光共聚焦專用皿經多聚賴氨酸和層黏連蛋白雙重包被。
[0013]進一步的，所述熒光指示劑為濃度2 ymol/L的Fluo-4/AM。
[0014]進一步的，所述培養箱內的孵育條件為37°C孵育30min。
[0015]進一步的，所述掃描條件為激發波長488nm，發射波長515nm，檢測15min，得到I丐熒光圖像。
[0016]本發明的有益效果在于:Ca2+作為重要的胞內信使，對神經元的多種生理功能如興奮性、神經遞質的釋放、突觸傳遞等產生決定性影響，故細胞內Ca2+濃度變化是細胞功能檢測的一項重要指標。本發明的大鼠脊髓角神經元鈣濃度測定方法，可用于觀察皮質酮對培養的脊髓背角神經元Ca2+濃度的影響，為研究皮質酮對脊髓背角感覺神經元功能的調節及其作用機制創造了條件。
【附圖說明】
[0017]圖1所示為本發明實施例加入C0RT(1 μmol/L)前脊髓背角神經元的基礎熒光圖；
[0018]圖2所示為本發明實施例加入C0RT(1 μπιοΙ/L)后脊髓背角神經元熒光圖；
[0019]圖3所示為本發明實施例加入C0RT(1 μπιοΙ/L)后脊髓背角神經元量效結果中鈣熒光強度曲線變化圖；
[0020]圖4所示為本發明實施例不同劑量CORT對脊髓背角神經元Ca2+濃度影響的統計圖；
[0021]圖5所示為本發明實施例加入C0RT(1 μπιοΙ/L)后脊髓背角神經元信號通路中鈣熒光強度變化曲線圖；
[0022]圖6所示為本發明實施例孵育液中無鈣離子時加入C0RT(1 μπιοΙ/L)后脊髓背角神經元信號通路中鈣熒光強度變化曲線圖；
[0023]圖7所示為本發明實施例RU38486(10 μπιοΙ/L)預孵育20min后加入C0RT(1 ymol/L)后的鈣熒光強度曲線圖；
[0024]圖8所示為本發明實施例PTX(100ng/ml)預孵育24h后加入C0RT(1 ymol/L)后的鈣熒光強度變化曲線圖；
[0025]圖9所示為本發明實施例CORT致脊髓背角神經元Ca2+濃度升高作用的藥理學特征圖。
【具體實施方式】
[0026]下文將結合具體附圖詳細描述本發明具體實施例。應當注意的是，下述實施例中描述的技術特征或者技術特征的組合不應當被認為是孤立的，它們可以被相互組合從而達到更好的技術效果。
[0027]實施例
[0028]本發明的大鼠脊髓角神經元鈣濃度測定方法，包括以下步驟:
[0029]I脊髓背角神經元的培養
[0030]取SD乳鼠(< 3d)，經75%乙醇消毒后斷頭處死，迅速取出脊髓，在解剖顯微鏡下眼科刀沿界溝分離出脊髓背角組織，迅速剝除脊髓外膜，將脊髓背角組織剪成小塊(約1mm3)，轉移至離心管中，加入0.125%胰蛋白酶置于37°C、5% CO2的細胞培養箱內消化30min ;然后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基終止其消化；吹打成細胞懸液，置離心機1000r/min離心5min，棄上清液；加入NB/B27培養基200 μ I重懸細胞，接種于經多聚賴氨酸和層黏連蛋白雙重包被的激光共聚焦專用皿中，培養箱內靜置3h ;加入1.5ml NB/B27培養基(含青霉素、鏈霉素)。
[0031 ] 2激光共聚焦技術檢測神經元Ca2+濃度變化
[0032]將脊髓背角神經元接種在激光共聚焦專用皿中，實驗為5組:
[0033]I)對照組；
[0034]2)皮質酮(CORT)組(0.1、1、10 μ mol/L)；
[0035]3)無鈣液+CORT組:孵育液為無鈣液時，給予CORT (I μ mol/L);
[0036]4)糖皮激素受體阻斷劑RU38486+C0RT組:孵育液含糖皮激素受體(glucocorticoi