一種口服液大鼠模型及測定對模型影響的實驗方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥理研宄領域，尤其涉及一種口服液大鼠模型及測定對模型影響的實 驗方法。
【背景技術】
[0002] 心臟病是以發病率高、病死率高、致殘率高、復發率高為特點的疾病，是世界范圍 內人口死亡的第三位病因和成人殘疾的首要原因。近10年來，我國隨著人口老齡化以及受 行為、社會環境因素的影響，仍有不斷上升的趨勢。
[0003] 心力衰竭又稱為心功能不全。傳統概念認為由于不同病因的心血管疾病所致的心 臟損害，特別是心室肌收縮和舒張功能受損，在有適量靜脈回流情況下，心臟不能維持足夠 的排血量，導致周身組織灌注量減少，肺循環和（或）體循環淤血的一組臨床綜合征。新的 概念：心衰是一組多種神經體液因子參與，促使心功能不全持續發展的臨床綜合癥，是各種 心臟病最終結局。臨床上以組織血液灌注不足以及肺循環和體循環淤血為主要特征。心衰 不是一個獨立的疾病，而是各種心臟病的嚴重階段，其發病率和死亡率極高。
[0004] 通過臨床觀察實驗進一步探討口服液治療氣虛型慢性心力衰竭的療效及不良反 應情況，并探討口服液治療慢性心力衰竭的作用機制。
【發明內容】
[0005] 本發明實施例的目的在于提供一種口服液對大鼠模型影響的實驗方法，旨在研宄 益氣活血祛濕利水藥口服液對不同證型慢性心力衰竭的作用。
[0006] 本發明是這樣實現的，一種口服液對大鼠模型影響的實驗方法包括對大鼠耐氧模 型的影響的實驗、對大鼠慢性心衰模型的影響的實驗、對大鼠急性心衰模型的影響的實驗、 對水負荷大鼠模型的影響的實驗、急性毒性實驗；
[0007] 所述的對大鼠耐氧模型的影響的實驗包括對小鼠常壓耐缺氧時間的影響的實驗、 對小鼠減壓耐缺氧時間的影響的實驗、對小鼠耳殼微循環的影響的實驗。
[0008] 進一步，所述的對小鼠常壓耐缺氧時間的影響的實驗的具體方法為：
[0009] 取18~21g小鼠60只，雌雄各半，隨機分為5組分別灌服大、中、小劑量組口服液， 芪藶強心膠囊混懸液和同體積的生理鹽水，灌胃量均為〇. 3ml/10g ;每天給藥1次，連續給 藥7天；于第7天灌胃給藥1小時，禁食12小時，將小鼠放入盛有IOg鈉石灰的125ml磨口 廣口瓶中，每瓶1只，瓶口涂凡士林密封，立即用秒表記錄每只小鼠從瓶口密封到死亡的時 間，以呼吸停止為小鼠死亡指標，觀察小鼠存活時間。
[0010] 進一步，所述的對小鼠減壓耐缺氧時間的影響的實驗的具體方法為：
[0011] 取18~21g小鼠60只，雌雄各半，隨機分為5組，分別灌服大、中、小劑量口服液， 芪藶強心膠囊混懸液及同體積生理鹽水；每天給藥1次，連續給藥7天；于第7天灌胃1小 時，禁食12小時，將小鼠放入盛有IOg鈉石灰的125ml磨口廣口瓶內，連接減壓裝置，瓶口 瓶涂凡士林密封；立即用秒表記錄每只小鼠從瓶口密封到死亡時間，以呼吸停止為死亡指 標，記錄小鼠存活時間。
[0012] 進一步，所述的對小鼠耳殼微循環的影響的實驗的具體方法為：
[0013] 取18~21g小鼠60只，雌雄各半，隨機分為5組，分別灌服大、中、小劑量口服液 組，芪藶強心膠囊混懸液及同體積生理鹽水；每天給藥1次，連續給藥10天，第10天灌胃后 Ih開始試驗；小鼠腹腔注射5 %的0. 06ml/10g水合氯醛進行麻醉，將麻醉好的小鼠腹部向 下固定在小鼠觀察臺上，調節耳托高度，使耳廓平展在耳托上，在耳廓表面滴加少許香柏 油，將觀察臺置于顯微鏡的載物臺上，用全自動圖像分析儀觀察各組小鼠耳廓細動脈（A)、 細靜脈（V)管徑、血流速度及毛細血管開放數，調節視野范圍，使正常小鼠耳殼微循環情況 相似；立即尾靜脈注射鹽酸腎上腺素注射液（l〇mg/kg)，2min后，分別觀察各小鼠耳廓耳廓 細動脈（A)、細靜脈（V)管徑、血流速度及毛細血管開放數。
[0014] 進一步，所述的對大鼠慢性心衰模型的影響的實驗的具體方法為：
[0015] 步驟一、分組給藥：
[0016] 取體重200_220g健康雄性大鼠造慢性心衰模型，采用腹主動脈縮窄法建立；方法 為大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40mg/kg)麻醉，劍突下腹正中切口，分層打開腹腔，在腎 動脈水平以上鈍性游離腹主動脈，將7號針頭平行置于腹主動脈上，用0號手術絲線將腹 主動脈和針頭一同結扎，然后緩慢將針頭撤出，使大鼠腹主動脈直徑縮窄為〇.7_左右，分 層關腹；術后腹腔注射青霉素，每天1次，連續6天，預防感染；假手術組開腹后將手術絲線 穿過腹主動脈，不結扎，其它操作同手術組；手術后4周，取手術成功大鼠72只，隨機分為 6組，分別灌服大、中、小劑量口服液、芪藶強心膠囊混懸液，模型組均灌服同體積生理鹽水， 灌服標準為2ml/100g ;另取單做解剖手術、不結扎腹主動脈，假手術4周成功的12只雄性 大鼠作為假手術組，灌服同體積生理鹽水，灌服標準為2ml/100g ;每天給藥1次，連續給藥6 周；各組大鼠均每天上午給藥、下午喂飼；
[0017] 步驟二、進行心臟動力學變化指標、心臟指數、心臟形態變化、生化指標的測定。
[0018] 進一步，對大鼠慢性心衰模型的影響的實驗中所述的心臟動力學變化指標的測定 的具體方法為：
[0019] 于最后1次灌胃后Ih后（禁食不禁水12h)，大鼠用20%烏拉坦腹腔注射麻醉，用 量為lg/kg，將大鼠固定于實驗臺，分離右頸總動脈，遠端結扎，近端夾閉血管，在動脈壁剪 一小口，插入直徑為1mm帶肝素的心導管，經壓力轉換器連接多導生理記錄儀，緩慢推進導 管，觀察示波器，當出現左室波型后停止推進，穩定2分鐘后記錄HR、左室收縮內壓（LVSP)、 左室舒張末壓（LVEDP)、左室內壓最大變化速率（±dp/dtmax)。
[0020] 進一步，對大鼠慢性心衰模型的影響的實驗中所述的心臟指數的測定的具體方法 為：
[0021] 左室舒、縮功能測定完后，股動脈放血處死動物，取血分離血清測定血清LDH、BNP 和cTnl ;然后取全心稱重，再分離左心室稱重，計算全心指數和左心室指數；稱重前用吸水 紙吸去心臟內的血液。
[0022] 進一步，對大鼠慢性心衰模型的影響的實驗中所述的心臟形態變化的測定的具體 方法為：
[0023] 實驗結束，處死大鼠，取心臟，切取約0. 5cm3左心室組織，10%甲醛固定，石蠟包 埋、切片、HE染色，進行病理組織學檢查；評分標準為：
[0024] 0分：正常；1分：輕度心肌纖維肥大，左室增厚，心肌輕度變性；2分：中度心肌纖 維肥大，左室增厚，心肌中度變性；3分：重度心肌纖維肥大、左室厚度、心肌重度變性。
[0025] 進一步，對大鼠慢性心衰模型的影響的實驗中所述的生化指標的測定包括乳酸脫 氫酶的測定、大鼠腦鈉素/腦鈉尿肽（BNP)ELISA的測定、大鼠心肌肌鈣蛋白I(cTnl)的 ELISA測定。
[0026] 進一步，所述的對大鼠急性心衰模型的影響的實驗的具體方法為：
[0027] 步驟一、分組給藥：
[0028] 取體重220~240g大鼠60只，雄性，隨機均分為6組，每組12只，其中1組為空 白對照組，另5組造大鼠急性心衰模型；造模型5組分別灌服大、中、小劑量口服液、芪藶強 心膠囊混懸液和同體積的生理鹽水，灌服標準為2ml/100g ;空白對照組灌同體積的生理鹽 水，灌服標準為2ml/100g ;每天給藥1次，連續給藥7天。于最后1次給藥后0. 5h，造模型 5組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射，注射標準為3ml/kg，大鼠麻醉后，仰臥于手術臺并固 定，分離氣管及右側頸總動脈，分別進行氣管及頸總動脈插管，氣管插管連接動物呼吸機行 機械通氣，頸總動脈插管連接壓力傳感器，將信號輸入微機生物機能實驗系統；心室導管插 入左心室，連接壓力傳感器，手術后穩定IOmin后，記錄心率（HR)、動脈收縮壓（SP)、動脈 舒張壓（DP)、動脈平均壓（AP)、左心室收縮壓（LVSP)、左心室終末舒張壓（LVEDP)、左心室 內壓最大上升速率（+dp/dtmax)、左心室內壓最大下降速率（一dp/dtmax);記錄正常大鼠 各項指標后，從尾靜脈推注35%普羅帕酬，注射標準為3ml/kg，3~5min推完，注射后記錄 5、10、15、20、30、40min上述指標的變化，取血，離心分離血清，冷凍保存，測血清肌鈣蛋白水 平；
[0029] 步驟二、進行心臟動力學變化的測定、心臟指數的測定、心臟形態變化的測定、 ELISA法測定大鼠心肌肌鈣蛋白I (cTnl)。
[0030] 進一步，對大鼠急性心衰模型的影響的實驗中所述的心臟動力學變化的測定的具 體方法為：
[0031] 于最后1次灌胃后Ih后（禁食不禁水12h)，大鼠用20%烏拉坦腹腔注射麻醉， 注射標準為lg/kg，將大鼠固定于實驗臺，分離右頸總動脈，遠端結扎，近端夾閉血管，在動 脈壁剪一小口，插入直徑為1mm帶肝素的心導管，經壓力轉換器連接多導生理記錄儀，緩慢 推進導管，觀察示波器，當出現左室波型后停止推進，穩定2分鐘后記錄HR、左室收縮內壓 (LVSP)、左室舒張末壓（LVEDP)、左室內壓最大變化速率（±dp/dtmax)。
[0032] 進一步，對大鼠急性心衰模型的影響的實驗中所述的心臟指數的測定的具體方法 為：
[0033] 左室舒、縮功能測定完后，股動脈放血處死動物，取血分離血清測定血清LDH、BNP 和cTnl ;然后取全心稱重，再分離左心室稱重，計算全心指數和左心室指數；稱重前用吸水 紙吸去心臟內的血液。
[0034] 進一步，對大鼠急性心衰模型的影響的實驗中所述的心臟形態變化的測定的具體 方法為：
[0035] 實驗結束，處死大鼠，取心臟，切取約0. 5cm3左心室組織，10%甲醛固定，石蠟包 埋、切片、HE染色，進行病理組織學檢查；評分標準為：
[0036] 0分：正常；1分：輕度心肌纖維肥大，左室增厚，心肌輕度變性；2分：中度心肌纖 維肥大，左室增厚，心肌中度變性；3分：重度心肌纖維肥大、左室厚度、心肌重度變性。
[0037] 進一步，所述的對水負荷大鼠模型的影響的實驗的具體方法為：
[0038] 取清潔級體重180~200g大鼠，wistar，雄性，實驗前先篩選大鼠泌尿作用，大鼠 禁食不禁水12h，灌服25ml/kg的生理鹽水，2h內收集的尿量達到所灌入量的40%以上的 大鼠可用于利尿實驗。取篩選合格的大鼠60只，隨機分為6組，每組10只；于實驗前1天 晚上大鼠禁食不禁水，第2天各組大鼠分別按20ml/kg的灌胃體積灌服大、中、小劑量的口 服液、呋塞米片混懸液、芪藶強心膠囊混懸液和同體積的蒸餾水。立即輕壓下腹部使膀胱排 空，立即將大鼠放入代謝籠，每籠一只，每隔Ih記一次尿量，共計5h，收集給藥后5h的總尿 量，測尿液中Na+、K+、Cr的濃度。
[0039] 進一步，所述的急性毒性實驗的具體方法為：
[0040] 取體重19~22g小鼠40只，雌雄各半，隨機分為口服液組和生理鹽水對照組；實 驗前禁食不禁水12h，口服液組按小鼠可灌服的最大體積灌服最大可灌服濃度的口服液混 懸液，并于1日之內連給3次，每次間隔8h;生理鹽水對照組灌服同體積的生理鹽水。然后 給動物以正常飲食，連續觀察14天。
【附圖說明】
[0041] 圖1是本發明實施例提供的一種口服液對大鼠模型影響的實驗方法流程圖。
【具體實施方式】