一種濾除DNase高通量測序數據中DNA堿基傾向性偏差的方法與流程

本發明屬于分子生物信息檢測與分析領域，具體涉及一種有效提高DNase高通量測序數據的檢測信息準確性的濾除DNase高通量測序數據中DNA堿基傾向性偏差的方法。

背景技術：

目前，DNA蛋白結合位點的檢測主要采用染色質免疫共沉淀技術(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)。而將ChIP實驗結果與高通量測序技術相結合的ChIP-Seq技術，則能有效地在全基因組范圍內檢測目的功能蛋白在DNA上的結合位點。ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質免疫共沉淀技術(ChIP)利用與目的蛋白特異性結合的酶來富集結合有目的蛋白的DNA片段，并對其進行純化與文庫構建。然后對富集得到的DNA片段進行高通量測序，再將測序獲得的數百萬條讀數序列精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內結合有目的蛋白的DNA區段信息，進而通過各種分析算法得到目的蛋白DNA結合位點。

然而，ChIP-Seq技術也有諸多不足之處，首先是富集目的蛋白的結合酶具有特異性，從而導致某些蛋白因找不到合適的特異結合酶而無法進行檢測；其次，一次實驗只能檢測一種蛋白，耗時耗力，成本高，無法大規模使用；第三，更為重要的是，由于實驗獲取的與目的蛋白結合的DNA片段較長，測序時只能對其兩端進行部分測序，由于測序區域并不是結合位點本身，因此，ChIP-Seq技術對DNA蛋白結合位點的檢測分辨率無法達到單堿基。

針對上述問題，近幾年產生了一種新的DNA蛋白結合位點檢測技術--基于DNase高通測序信息的DNA蛋白結合位點檢測技術，即DNase-Seq技術。DNase-Seq的原理是：首先利用DNase核酸剪切酶對DNA進行酶切處理。則沒有DNA蛋白結合的DNA區域將被DNase核酸剪切酶隨機地切斷，而有DNA蛋白結合的DNA區域由于受到結合蛋白的阻礙特異性不被切斷。隨后，對酶切處理過的DNA片段進行純化與文庫構建，再進行測序，從而獲得全基因組范圍內DNase核酸剪切酶的酶切信息。在酶切信息中，蛋白結合位點處的酶切信息將特異性減弱，就像在DNA上留下一個個足跡一樣，從而可以精確鑒定DNA結合蛋白在DNA分子上的結合位點。

與ChIP-Seq技術相比，DNase-Seq技術的優點非常突出。首先，由于不具有特異性，DNase-Seq可一次性在全基因組范圍內同時檢測多種DNA蛋白的結合位點；其次，由于一次性檢測多種DNA蛋白的結合位點，DNase-Seq大幅提高了檢測效率并降低了檢測成本，使大規模進行DNA蛋白結合位點檢測成為可能；第三，更為重要的是，由于測序起始位置就是酶切位置，DNase-Seq對DNA蛋白結合位點的檢測分辨率可達單堿基。

然而，近期發現DNase核酸剪切酶在切割DNA時存在一定的DNA堿基傾向性，這將對 DNA蛋白結合位點的識別產生不利的影響。如何去除該傾向性已成為基于DNase-Seq的DNA蛋白結合位點識別的一個關鍵問題。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種濾除DNase高通量測序數據中DNA堿基傾向性偏差的方法。

本發明的目的是這樣實現的：

(1)DNase-Seq實驗數據酶切位點區域DNA堿基獲取

依據DNase-Seq實驗數據在基因組中的位置，提取每一個實驗數據對應酶切位點附近區域的DNA堿基。本發明選用酶切位點附近6個位點的堿基，即以酶切位點為中心，左右各取3個堿基。

(2)DNase-Seq實驗數據DNA堿基傾向性獲取

本發明選用酶切位點附近6個位點的堿基，每個堿基有A、C、G、T等4種取值，則6個位點堿基共有4096種堿基組合。通過統計整個DNase-Seq實驗數據酶切位點處這4096種堿基組合出現的頻次，即可獲得DNase-Seq實驗數據的DNA堿基傾向性。

(3)DNA堿基傾向性去除

設有m個蛋白結合位點，每個結合位點包含n個堿基，則：第i個結合位點的DNase檢測信號為：[S_i1,S_i2,…,S_in]。其值和為：

考慮DNase的DNA堿基傾向性，則第i個結合位點第j列的DNase檢測信號為：S_ij＝[(1-w)P_ij+wB_ij]R_i。其中，P_ij為第i個結合位點第j列處與DNA結合蛋白的蛋白結構相對應的DNase的固有切割概率，B_ij為第i個結合位點第j列處與該處DNA堿基傾向性相對應的DNase的切割概率。P_ij是穩定的，可用于DNA蛋白結合位點識別，而B_ij是不穩定的，應予以濾除。

具體濾除方法如下：

其中，S_ij,R_i可從實驗數據中直接得到。B_ij則根據前一步驟獲取的DNase-Seq實驗數據的DNA堿基傾向性得到。w為權值，取值范圍為[0,1]之間，需要進一步確定。

對于m個蛋白結合位點，當權值w取不同值時，會得到不同的[P_i1,P_i2,…,P_in]，1≤i≤m。設則當m個[P_i1,P_i2,…,P_in]與[P₁,P₂,...,P_n]之間的m個相關性值的中位值最大時， 此時的w值為最優值。

本發明的有益效果在于：通過所發明的方法可以精確地濾除DNase高通量測序數據中含有的DNA堿基傾向性偏差，以生成更加準確的DNase-Seq測序結果，從而為后續更高層次的應用分析提供數據保障。

附圖說明

圖1為DNase-Seq實驗數據DNA堿基傾向性直方圖。

圖2為w權值的評價值變化曲線。

圖3為本發明流程圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明做進一步描述。

作為DNA蛋白結合位點檢測的新技術，DNase-Seq技術具有眾多突出的優點。由于不具有特異性，DNase-Seq可一次性在全基因組范圍內同時檢測多種DNA蛋白的結合位點；由于一次性檢測多種DNA蛋白的結合位點，DNase-Seq大幅提高了檢測效率并降低了檢測成本，使大規模進行DNA蛋白結合位點檢測成為可能；由于測序起始位置就是酶切位置，DNase-Seq對DNA蛋白結合位點的檢測分辨率可達單堿基。

然而，近期發現DNase核酸剪切酶在切割DNA時存在一定的DNA堿基傾向性，這將對DNA蛋白結合位點的識別產生不利的影響。本發明即是針對該問題提出的一種濾除DNase高通量測序數據中DNA堿基傾向性偏差的方法。

1、DNase-Seq實驗數據酶切位點區域DNA堿基獲取

依據DNase-Seq實驗數據在基因組中的位置，提取每一個實驗數據對應酶切位點附近區域的DNA堿基。本發明選用酶切位點附近6個位點的堿基，即以酶切位點為中心，左右各取3個堿基。

2、DNase-Seq實驗數據DNA堿基傾向性獲取

本發明選用酶切位點附近6個位點的堿基，每個堿基有A、C、G、T等4種取值，則6個位點堿基共有4096種堿基組合。通過統計整個DNase-Seq實驗數據酶切位點處這4096種堿基組合出現的頻次，即可獲得DNase-Seq實驗數據的DNA堿基傾向性。

3、DNA堿基傾向性去除

設有m個蛋白結合位點，每個結合位點包含n個堿基，則：第i個結合位點的DNase檢測信號為：[S_i1,S_i2,…,S_in]。其值和為：

考慮DNase的DNA堿基傾向性，則第i個結合位點第j列的DNase檢測信號為： S_ij＝[(1-w)P_ij+wB_ij]R_i。其中，P_ij為第i個結合位點第j列處與DNA結合蛋白的蛋白結構相對應的DNase的固有切割概率，B_ij為第i個結合位點第j列處與該處DNA堿基傾向性相對應的DNase的切割概率。P_ij是穩定的，可用于DNA蛋白結合位點識別，而B_ij是不穩定的，應予以濾除。

具體濾除方法如下：

其中，S_ij,R_i可從實驗數據中直接得到。B_ij則根據前一步驟獲取的DNase-Seq實驗數據的DNA堿基傾向性得到。w為權值，取值范圍為[0,1]之間，通過下述方法確定：

對于m個蛋白結合位點，當權值w取不同值時，會得到不同的[P_i1,P_i2,…,P_in]，1≤i≤m。設則當m個[P_i1,P_i2,…,P_in]與[P₁,P₂,...,P_n]之間的m個相關性值的中位值最大時，此時的w值為最優值。

4、實驗驗證

從UCSC國際生物信息網站下載人類基因組堿基序列數據，以及國際ENCODE計劃UW大學測得的人類K562細胞系DNase-Seq測序數據和NFYA轉錄因子ChIP-Seq測序數據。

根據每個DNase-Seq測序數據酶切位點在人類基因組中的位置，提取附近6個位點的堿基，即以酶切位點為中心，左右各取3個堿基。統計酶切位點處4096種堿基組合出現的頻次，獲得DNase-Seq實驗數據的DNA堿基傾向性。該傾向性的直方圖如圖1所示(橫軸為堿基組合，縱軸為頻次)。由圖1可見，DNase-Seq實驗數據存在明顯的DNA堿基傾向性。

根據NFYA轉錄因子的ChIP-Seq測序數據，識別出953個NFYA蛋白結合位點。每個結合位點包含201個堿基。

利用本發明方法對DNase-Seq實驗數據進行DNA堿基傾向性濾除。當w取某一權值時，每個結合位點濾除DNA堿基傾向性的DNase檢測信號為[P_i1,P_i2,…,P_in]，1≤i≤953。計算每個結合位點[P_i1,P_i2,…,P_in]與[P₁,P₂,...,P_n]之間的Pearson相關值，這里n取值為201。選取953個相關值的中位值作為該w值是否優異的評價值。讓w值由0到1變化，獲得如圖2所示的w值的評價值變化曲線(橫軸為w值，縱軸評價值)。由圖2可見，當w值為0.15時，評價值達到最大并不再增加，此時的w值應為最優值，并進而得到與之對應的濾除DNA堿基傾向性的DNase-Seq檢測信息。

作為DNA蛋白結合位點檢測的新技術，DNase-Seq技術具有突出優點。由于不具有特異性，DNase-Seq可一次性在全基因組范圍內同時檢測多種DNA蛋白的結合位點；由于一次性檢測多種DNA蛋白的結合位點，DNase-Seq大幅提高了檢測效率并降低了檢測成本，使大規模進行DNA蛋白結合位點檢測成為可能；由于測序起始位置就是酶切位置，DNase-Seq對DNA蛋白結合位點的檢測分辨率可達單堿基。然而，DNase核酸剪切酶在切割DNA時存在一定的DNA堿基傾向性，這將對DNA蛋白結合位點的識別產生不利的影響。本發明即是針對該問題提出的一種濾除DNase高通量測序數據中DNA堿基傾向性偏差的方法。