胞；
[0032]圖2球形胚和魚雷胚；
[0033]圖3子葉胚(左)和快繁突變體再生植株(右:矮生沿階草);
[0034]圖4抗冷性較強的同質突變胚狀體；
[0035]圖5同質突變體的完整植株；
[0036]圖6盆栽矮生沿階草同質突變體庫(左)和親本種質(右)。
【具體實施方式】
[0037]下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0038]實施例1以矮生沿階草為實驗材料進行說明。步驟是:
[0039]I)高頻體細胞胚外植體材料準備和早期體細胞胚外植體的培養:選取室外健康無病蟲害的矮生沿階草植株，剝去老葉，取其幼嫩莖基并帶3-4片幼葉，無菌消毒后放入無菌培養基光下培養(1/2MS+2.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+蔗糖 20g/L+0.7 % 瓊脂)50_60d，中間繼代一次，組培成試管苗，取其試管苗葉、莖基部0.5-1.0cm大小外植體，放在體胚發生誘導培養基(MS+BA (0.2mg/L) +NAA (0.5mg/L) +2.4D (0.5mg/L) + 蔗糖 30g/L+3.5g/Lphytagel)上暗培養50_60d，中間繼代一次，將產生的初生胚狀體轉入高頻體細胞胚培養基(MS+BA 2mg/L+NAA 0.5mg/L+鹿糖 40g/L+3.5g/L phytagel)上光下培養 50_60d，中間繼代一次，就會持續不斷地大量產生各個發育時期的體細胞胚(球形胚、魚雷胚和子葉胚)，將成熟胚狀體(子葉胚)轉入無激素的成苗培養基(MS+白糖30g/L+0.7%瓊脂)培養，20-25天后形成完整再生植株，以其作為高頻體細胞胚材料來源。切取其葉、莖基部0.5cm大小組織塊作為高頻體細胞胚外植體材料，放在體胚發生誘導培養基上培養7-10d，此時大部分體細胞為單細胞時期，稱作早期體細胞胚(圖1:胚性單細胞)，在體胚發生的早期作為誘變劑處理材料。
[0040]2)物理誘變劑準備:6°Co_ γ射線源由江蘇里下河地區農業科學研究所提供；輻射劑量設置為 0.0、5Gy、1Gy、15Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy 8 個不同處理；
[0041]3)早期體細胞胚外植體的γ射線處理:將早期體細胞胚外植體分成8組，用于8個不同輻射劑量的處理；處理結束后，重新放回無菌室進行體細胞胚分化培養；
[0042]4)體細胞胚分化培養:將經γ射線誘變處理過的早期體細胞胚外植體轉移到溫度為25-28°C無菌室進行暗培養，50-60d左右可見外植體上大大小小生長發育出幾十個早期同質突變胚狀體(圖2:球形胚、魚雷胚)。常溫暗培養可保證快速獲得具廣泛基因變異的遺傳穩定的同質飽和突變體材料。
[0043]5)同質突變胚狀體快繁増殖培養:將上述早期同質突變胚狀體切成0.5cm大小塊，分別編號轉接于體細胞胚快繁增殖培養基(MS+BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖40g/L+3.5g/L phytagel)，放在25-28 °C光下培養50_60d，中間繼代一次，光照強度為1500-20001X，光照時間為每天10-14小時，即可保證快速繁殖各種突變胚狀體又可獲得相應成熟的同質突變胚狀體。(圖3:子葉胚和快繁突變體再生植株)。
[0044]6)同質突變胚狀體的篩選及快繁増殖培養:將上述快繁的各類同質突變胚狀體各取出一半，切成0.5cm大小塊，分別編號繼續轉接于體細胞胚快繁增殖培養基，放入5_8°C低溫無菌培養箱中弱光下(500-8001x)培養25_30d，之后再繼代轉入25_28°C光下(1500-20001x)培養25-30d，可獲得抗冷性較強的成熟同質突變胚狀體(圖4:抗冷性較強的同質突變胚狀體)。
[0045]7)成熟同質突變胚狀體再生植株:將上述快繁増殖的具豐富變異的成熟突變胚狀體及抗冷性強的成熟突變胚狀體均分別編號轉接于植株再生培養基中，在無菌室溫度25-28°C光下培養20-25d，獲得具根、莖、葉完整的同質突變體再生植株(圖5:同質突變體的完整植株)。
[0046]8)同質突變體再生植株煉苗移栽:當根長生長到1-1.5cm時，將各突變體株系分別編號移栽到花盆，選擇輕型基質，放置在溫室大棚內，自動間歇噴霧裝置澆水。成活率可達100%。揭去培養瓶的封口膜，在室內煉苗I?2d，用鑷子小心取出小苗，洗凈根上附著的培養基，移栽到裝有輕型基質(泥炭:蛭石=1:1)的花盆中，放入溫室溫度為24°C?26°C，適當遮蔭，或將小苗放到苗床下，自動間歇噴霧裝置澆水。
[0047]9)田間同質突變體庫建立:60d后選擇溫暖濕潤陰天將各個突變體株系移栽到室外林下或田間區試圃，由于小苗生長旺盛，對移栽大田的條件要求也不高，極易種植，小苗的成活率可達100%。后期根據生育期記載突變體相關性狀，在突變體生長發育的各階段進行突變體鑒定、篩選。以此建立起沿階草γ射線飽和同質突變體庫(圖6:盆栽矮生沿階草同質突變體庫和親本種質)，用于后續沿階草選擇育種和基因功能組學等方面的研究。
【主權項】
1.一種矮生沿階草r射線同質突變體庫快速創制方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: 1)高頻體細胞胚外植體材料準備:選取室外健康無病蟲害的矮生沿階草植株，取其幼嫩莖葉，無菌消毒后在無菌培養基中組培成無菌試管苗，取其莖葉基部0.5-1.0cm大小外植體，通過高頻體胚再生系統的培養，就會持續不斷地產生體細胞胚和胚狀體及完整地再生植株，以再生植株作為高頻體細胞胚外植體材料來源； 2)早期體細胞胚外植體的培養:將上述具高頻體細胞胚再生能力的外植體切取其葉、莖基部0.5cm大小組織塊，放在體胚發生誘導培養基上25-28°C無菌室暗培養7_10d，此時大部分體細胞為單細胞時期，稱作早期體細胞胚，以此作為誘變劑處理材料； 3)物理誘變劑準備:包括6°Co-y射線源準備及輻射劑量的設置； 4)早期體細胞胚外植體的γ射線處理:將早期體細胞胚外植體分成8組，用于8個不同福射劑量的處理； 5)體細胞胚分化培養:將經γ射線誘變處理過的早期體細胞胚外植體，重新放回無菌室在溫度25-28°C下暗培養50-60d，中間繼代一次，有利于體細胞胚分化，可見外植體上大大小小生長發育出幾十個早期突變胚狀體； 6)同質突變胚狀體快繁増殖培養:將上述早期突變胚狀體切成0.5cm大小塊，分別編號轉接于體細胞胚快繁增殖培養基，放在25-28°C光下培養50-60d，中間繼代一次，可獲得大量成熟的同質突變胚狀體； 7)同質突變胚狀體的篩選及快繁増殖培養:將上述快繁的各類同質突變胚狀體取出一部分，切成0.5 c m大小塊，分別編號繼續轉接于體細胞胚快繁增殖培養基，放入5_8°C低溫無菌培養箱中弱光下(500-8001x)培養25_30d，之后再繼代轉入25-28°C光下(1500-20001x)培養25-30d，可獲得抗冷性較強的成熟同質突變胚狀體； 8)成熟同質突變胚狀體再生植株:將上述快繁増殖的具豐富變異的成熟突變胚狀體及抗冷性強的成熟突變胚狀體均分別編號轉接于植株再生培養基中，在無菌室溫度25-28°C光下培養20-25d，獲得具根、莖、葉完整的同質突變體再生植株； 9)同質突變體再生植株煉苗移栽:當根長生長到1-1.5cm時，將各突變體株系分別編號移栽到花盆，選擇輕型基質，放置在溫室大棚內，自動間歇噴霧裝置澆水； 10)田間突變體庫建立:60d后選擇溫暖濕潤陰天將各個突變體株系移栽到室外林下或田間區試圃，分別編號，記載相關性狀，在同質突變體生長發育的各階段進行突變體鑒定、篩選，以此建立起沿階草γ射線飽和同質突變體庫。2.根據權利要求1所述的一種矮生沿階草r射線同質突變體庫快速創制方法，其特征在于，所述步驟3)中輻射劑量設置:設置為0.0、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy8個不同處理。3.根據權利要求1所述的一種矮生沿階草r射線同質突變體庫快速創制方法，其特征在于，所述步驟3)中6°Co-y射線輻射劑量為20Gy。4.根據權利要求1所述的一種矮生沿階草r射線同質突變體庫快速創制方法，其特征在于，所述無菌培養基培養為1/2MS + 2.0 mg/L BA+ 0.5 mg/L NAA +20g/L蔗糖+0.7%瓊脂。5.根據權利要求1所述的一種矮生沿階草r射線同質突變體庫快速創制方法，其特征在于，所述誘導培養基為MS+0.2 mg/L BA+ 0.5 mg/L ΝΑΑ+0.5 mg /L 2，4-二氯苯氧乙酸+30g/ L 鹿糖+3.5g/L phytagelo6.根據權利要求1所述的一種矮生沿階草r射線同質突變體庫快速創制方法，其特征在于，所述高頻體胚再生系統的培養:是指將初生胚狀體轉入高頻體細胞胚培養基上光下培養50-60d，中間繼代一次，就會持續不斷大量地產生次生胚狀體即體細胞胚。7.根據權利要求6所述的一種矮生沿階草r射線同質突變體庫快速創制方法，其特征在于，所述高頻體細胞胚培養基為MS +2mg/L BA + 0.5mg/L NAA +40g/L蔗糖+3.5g/Lphytagelο8.根據權利要求1所述的一種矮生沿階草r射線同質突變體庫快速創制方法，其特征在于，所述步驟6)中體細胞胚快繁增殖培養基為MS + 2mg/L BA + 0.2mg/L NAA +40g/L鹿糖+3.5g/L phytagel，光照強度為1500_20001x，光照時間為每天10-14小時。9.根據權利要求1所述的一種矮生沿階草r射線同質突變體庫快速創制方法，其特征在于，所述步驟8)中植株再生培養基為1/2 MS+20g/ L白糖+ 0.7%瓊脂。
【專利摘要】本發明公開了一種矮生沿階草r射線同質突變體庫快速創制方法，包括如下步驟：1)高頻體細胞胚外植體材料準備；2)早期體細胞胚外植體的培養；3)物理誘變劑準備；4)早期體細胞胚外植體的γ射線處理；5)體細胞胚分化培養；6)同質突變胚狀體快繁増殖培養；7)同質突變胚狀體的篩選及快繁増殖培養；8)成熟同質突變胚狀體再生植株；9）同質突變體再生植株煉苗移栽；10)？田間突變體庫建立。本發明快速構建矮生沿階草r射線飽和同質突變體庫的方法，不但為沿階草功能基因組學、遺傳育種問題的深入研究奠定了基礎，同時為選育抗寒性強的矮生沿階草新品種提供最直接有效的同質突變體材料，具有重要的理論意義和應用價值。
【IPC分類】A01H1/06, A01H4/00
【公開號】CN105165603
【申請號】
【發明人】梁慧敏, 賈君, 顏志明, 董慧, 楊寶林
【申請人】江蘇農林職業技術學院
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月24日