53.2%的不定芽誘導率；
3)切割不定芽繼代增殖:
在無菌條件下將誘導2-3cm的不定芽從外植體上完整的切下，轉接到裝有增殖培養基(培養基配方為:MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKT+3% 蔗糖 +6.5g/L 瓊脂，pH 為 5.8)的廣口瓶中，為對比本發明增殖培養基的效果，同時選擇了另一種增殖培養基，培養基配方為:MS+1.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，pH為5.8(對比文件來自于曹彤彤等《百日草組織培養技術的研究》)，培養室溫度控制為24土1°C、光照強度控制為1800LX、光周期控制為光12h/暗12h下培養，培養20天左右得到大量芳菲2號幼苗，如圖2，統計兩種培養基配方對芳菲2號增值效率的影響，結果發現本發明不定芽增殖倍數達到11.3，而對比例為8.1 ;
4)煉苗:
篩選5-8cm的芳菲2號脫毒試管苗，轉移到光照強度為30001x的條件下，5天后，將培養溫度降低為21 ± 1°C，再過5天，打開廣口瓶封口，繼續煉苗5天；
5)水培生根處理:
為減少轉接對脫毒試管苗根系帶來的傷害，轉接前向廣口瓶內加入少量水，并用鑷子輕輕攪動培養基，以免把苗子倒出時損傷根，試管苗倒出后洗凈根上的培養基，移栽到裝有生根培養液(培養液配方為:500mg/L KN03,500mg/L NH4NO3,92.5mg/L MgSO4.7H20，173mg/L Ca (NO3)2.4H20，150mg/L KH2PO4, 32mg/L KCl，17mg/L MnSO4.7H20，19mg/L Na2-EDTA,14mg/L FeSO4.7H20，2.2mg/L MnSO4.4H20，0.8mg/L ZnSO4.7H20，0.8mg/L H3BO3,0.4mg/L KI, 50mg/L肌醇，lmg/L甘氨酸，0.0Smg/LVB^0.05mg/LVB6,混合制成生根營養液)的水培盤中的栽培板上，栽培密度1200苗/m2，株距2.5cm，行距2.5cm，水培器皿用盆底長X寬=44 X 32cm，盆高=15cm的塑料盆作為栽培盆，每盆放2L營養液，并有定植孔間距為2cm_3cm的栽培板漂浮在營養液上，將脫毒苗上方搭上一層透明的塑料薄膜，使其處于溫度24°C、濕度多90%、光照強度為25001x的清潔的溫室內環境生長；
6)水培壯苗:
生根培養7天后，脫毒苗根系基本發育完全，此時，撤掉塑料薄膜，倒掉生根營養液，給幼苗澆施壯苗營養液(營養液配方為:850mg/L KNO3, 750mg/L NH4NO3,165mg/L MgSO4.7Η20，75mg/L KH2PO4, 200mg/L CaCl2.2H20，20mg/L Na2-EDTA, 15mg/L FeSO4.7H20，10.5mg/LMnSO4.4H20，4.25mg/L ZnSO4.7H20，3.0mg/L H3BO3,0.4mg/L KI，0.12mg/L Na2M0O4.2H20，0.012mg/L CoCl2.6H20，0.012mg/L CuSO4.5H20，0.4mg/L KI，30mg/L 肌醇，0.5mg/L 甘氨酸，0.0Smg/LVB^0.05mg/LVB6，混合制成壯苗營養液)；
7)移栽:
當百日草脫毒苗長到12-15cm時，移栽到消過毒的等體積比例的草炭、珍珠巖、蛭石的基質上，移栽密度為行距15cm、株距10cm，塑料薄膜覆蓋保濕，12天后逐步除去薄膜，置于室外自然光下生長，獲得生長活力強的芳菲2號種苗，如圖3，統計移栽成活率達99%以上。
[0019]由實施例可見本發明效果顯著:(I)在步驟2)中，統計不定芽誘導率，對芳菲2號不定芽誘導率達到74.4%，顯著高于對比例53.2%的不定芽誘導率；統計步驟3)中不定芽增殖效率，本發明的不定芽增殖倍數達到11.3，顯著高于對比例8.1的增殖倍數；最終擴繁效率提高了近一倍；(2)獲得的種苗質量高、無病蟲害，弱苗或死苗率在1%以下；(3)苗移栽成活率比現有技術大大提高，移栽成活率達到約99%。
[0020]本領域技術人員可以根據本發明公開的內容和所掌握的本領域技術對本
【發明內容】
作出替換或變型，但是這些替換或變型都不應視為脫離本發明構思的，這些替換或變型均在本發明要求保護的權利范圍內。
【主權項】
1.一種百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，其特征在于:該方法步驟如下: 1)百日草脫毒苗前處理:將百日草脫毒苗清洗干凈并表面消毒，在無菌條件下切取葉柄和花托，移入裝有配制好的不定芽誘導培養基廣口瓶中； 2)不定芽的誘導:將接種有脫毒苗外植體的不定芽誘導培養基廣口瓶置于消毒處理過的培養室中光培養，誘導出不定芽； 3)切割不定芽繼代增殖:在無菌條件下將不定芽切下，移入裝有增殖培養基的廣口瓶中培養，得到大量百日草幼苗； 4)煉苗:逐步采用增強培養光照、降低培養溫度的方法進行煉苗； 5)水培生根處理:將煉苗后的脫毒試管苗從廣口瓶中取出，保留原有根系，再將組培苗栽于水培盤中的栽培板上，水培盤中加入生根營養液； 6)水培壯苗:生根培養7天后，倒掉生根營養液，加入壯苗營養液； 7)移栽:將脫毒苗移栽到消過毒的基質上，置于室外自然光下生長。2.根據權利要求1所述的百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，其特征在于:該方法的詳細步驟如下: 1)百日草脫毒苗前處理: 將百日草脫毒苗先用自來水反復沖洗，用毛刷蘸取洗潔精洗一遍后接著用超純水沖洗干凈，用70%酒精浸泡15s，再用無菌水沖洗兩次，0.1%升汞內加數滴吐溫20溶液浸泡5min，用無菌水沖洗4-5次，濾紙吸干，將百日草脫毒苗的葉柄和花托移入裝有不定芽誘導培養基的廣口瓶中； 2)不定芽的誘導: 為防百日草脫毒苗在生產過程中被病毒再浸染，培養室先經過消毒，消毒劑選用40%甲醛10ml/m3、高錳酸鉀5g/m3，對整個培養室進行熏蒸2小時，熏蒸后，再采用75%乙醇擦拭培養架進行表面消毒，然后將接種有百日草脫毒苗外植體的不定芽誘導培養基廣口瓶置于消毒處理過的培養室中光培養，培養室溫度控制為26土 1°C，以熒光燈為光源，光照強度控制為1500-2000LX，光周期控制為光14h/暗10h，25-30天誘導出不定芽； 3)切割不定芽繼代增殖: 在無菌條件下將誘導2-3cm的不定芽從外植體上完整的切下，轉接到裝有增殖培養基的廣口瓶中，培養室溫度控制為24± 1°C、光照強度控制為1500-2000LX、光周期控制為光12h/暗12h下培養，培養15-25天后可得到大量百日草幼苗； 4)煉苗: 篩選5-8cm的百日草脫毒試管苗，轉移到光照強度為2500-35001X的條件下，3_5天后，將培養溫度降低為20-22°C，再過3-5天，打開廣口瓶封口，繼續煉苗3-5天； 5)水培生根處理: 為減少轉接對脫毒試管苗根系帶來的傷害，轉接前向廣口瓶內加入少量水，并用鑷子輕輕攪動培養基，以免把苗子倒出時損傷根，試管苗倒出后洗凈根上的培養基，移栽到裝有生根培養液的水培盤中的栽培板上，栽培密度1000-1200苗/m2，株距2_3cm，行距2_3cm，水培器皿用盆底長X寬=44 X 32cm，盆高=15cm的塑料盆作為栽培盆，每盆放2L營養液，并有定植孔間距為2cm-3cm的栽培板漂浮在營養液上，將脫毒苗上方搭上一層透明的塑料薄膜，使其處于溫度22-25°C、濕度多90%、光照強度為2000-30001x的清潔的溫室內環境生 長； 6)水培壯苗: 生根培養7天后，脫毒苗根系基本發育完全，此時，撤掉塑料薄膜，倒掉生根營養液，給幼苗澆施壯苗營養液； 7)移栽: 當百日草脫毒苗長到12-15cm時，移栽到消過毒的基質上，移栽密度為行距15cm、株距10cm，塑料薄膜覆蓋保濕，10-15天后逐步除去薄膜，置于室外自然光下生長。3.根據權利要求1或2所述的百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，其特征在于:百日草品種選為芳菲I號、芳菲2號和芳菲3號。4.根據權利要求1或2所述的百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，其特征在于:步驟I)和2)中的不定芽誘導培養基的配方為:MS+0.5mg/L KT+1.5mg/L 6-BA+0.4mg/L GA+0.3g/L CH +3% 蔗糖 +6.5g/L 瓊脂，pH 為 5.8。5.根據權利要求1或2所述的百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，其特征在于:步驟3)中的增殖培養基配方為:MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKT+3%蔗糖+6.5g/L瓊脂，pH為5.8。6.根據權利要求1或2所述的百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，其特征在于:步驟5)和 6)中的生根培養液配方為:500mg/L KNO3, 500mg/L NH4NO3,92.5mg/L MgSO4.7Η20，173mg/L Ca (NO3)2.4Η20，150mg/L KH2PO4, 32mg/L KCl，17mg/L MnSO4.7H20，19mg/L Na2-EDTA,14mg/L FeSO4.7H20，2.2mg/L MnSO4.4H20，0.8mg/L ZnSO4.7H20，0.8mg/L H3BO3,0.4mg/LKI，50mg/L肌醇，lmg/L甘氨酸，0.0Smg/LVB^0.05mg/LVB6,混合制成生根營養液。7.根據權利要求1或2所述的百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，其特征在于:步驟5)和6)中的生根培養液的另一種可選配方為:950mg/L KN03，825mg/L NH4NO3,85mg/L KH2PO4,220mg/LCaCl2.2H20，185mg/L MgSO4.7H20，19mg/L Na2-EDTA,14mg/L FeSO4.7H20，llmg/L MnSO4.4H20，0.4mg/L KI，3.lmg/L H3BO3, 4.3mg/L ZnSO4.7H20，0.125mg/L Na2MoO4,0.0125mg/L CuSO4,0.0125mg/L CoCl2.6H20，50mg/L 肌醇，lmg/L 甘氨酸，0.0Smg/LVB!，0.05mg/LVB6，混合制成生根營養液。8.根據權利要求1或2所述的百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，其特征在于:步驟6)中的壯苗營養液配方為:850mg/L KN03，750mg/L NH4NO3,165mg/L MgSO4.7H20，75mg/LKH2PO4, 200mg/L CaCl2.2Η20，20mg/L Na2-EDTA, 15mg/L FeSO4.7Η20，10.5mg/L MnSO4.4Η20，4.25mg/L ZnSO4.7H20，3.0mg/L H3BO3,0.4mg/L KI，0.12mg/L Na2M0O4.2H20，0.012mg/LCoCl2.6H20，0.012mg/L CuSO4.5H20，0.4mg/L KI，30mg/L 肌醇，0.5mg/L 甘氨酸，0.05mg/LVB1,0.05mg/LVB6，混合制成壯苗營養液。9.根據權利要求1或2所述的百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，其特征在于:步驟7)中的消過毒的基質成分為等體積比例的草炭、珍珠巖、蛭石。
【專利摘要】本發明公開了一種百日草脫毒種苗的高效擴繁方法，包括以下步驟：1）百日草脫毒苗前處理；2）不定芽的誘導；3）切割不定芽繼代增殖；4）煉苗；5）水培生根處理；6）水培壯苗；7）移栽。本發明的高效擴繁方法解決了百日草脫毒苗擴繁過程中效率低下、易再次污染的問題，不僅能在短時間內擴繁出大量優良百日草脫毒種苗，而且還避免了百日草分株繁殖和種子繁殖所帶來的品種退化問題，而且操作簡單、易于工廠化推廣，具有較高的生產實用價值。
【IPC分類】A01H4/00, A01G31/00
【公開號】CN105165610
【申請號】
【發明人】不公告發明人
【申請人】陳丁龍
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月10日