組織的顆粒大小
[0026] 以培養20天的果肉愈傷組織為準，測量不同培養基和不同培養條件下誘導果肉 愈傷組織的大小，愈傷組織的直徑小于3毫米為不合格愈傷組織，愈傷組織直徑大于3毫米 為合格。
[0027] (2)愈傷組織的顆粒散碎度
[0028] 步驟（1)篩選完成后，篩選出大小合適的愈傷組織。顆粒散碎表示愈傷組織容易 松散，不緊密，愈傷組織表面毛刺狀不平滑。顆粒致密表示愈傷組織顆粒致密硬度高，愈傷 組織表面光滑狀，細胞致密，胞質密度高，愈傷組織邊緣清晰。
[0029] (3)愈傷組織的色澤
[0030] 愈傷組織合格顏色應該為黃白色，黃白色愈傷組織沒有水漬化現象，組織顆粒致 密，硬度高，愈傷組織表層細胞層清晰，有明顯的表層致密層結構，是合格質量好的愈傷組 織。
[0031] (4)愈傷組織的再分化能力
[0032] 愈傷組織分化能力好壞取決于前面三點，大小適中、組織顆粒致密、硬度較高、顏 色黃白色的愈傷組織具有很強的分化能力，分化出的愈傷組織也有很高的質量。否則愈傷 組織分化能力弱，分化出來的愈傷組織質量也不好。
[0033] 4、培養基配方篩選試驗過程
[0034] (1)將草莓'紅顏'的花后果肉分別接種于附加不同濃度6-BA、NAA的改良MS培養 基上研究不同配比的植物生長調節劑對草莓'紅顏'果肉愈傷組織誘導培養的影響，培養基 的PH值為5.8。培養基中附加蔗糖（20g/L)、瓊脂粉（6g/L)。具體的，每升MS培養基里含 有：KN03硝酸鉀1500mg/L、（NH4)2S04硫酸銨500mg/L、C0(NH2)2尿素200mg/L、MgS04?7H20 七水合硫酸鎂400mg/L、KH2P04磷酸二氫鉀200mg/L、KI碘化鉀1.lmg/L、MnS04?4H20四水 合硫酸錳20mg/L、ZnS04?7H20七水合硫酸鋅8mg/L、H3B03硼酸5mg/L、Fe-EDDHA乙二胺鄰 二羥基乙酸鐵10mg/L、CaCl2?2H20二水合氯化媽100mg/L、肌醇100mg/L、煙酸2mg/L、維生 素Bilmg/L、維生素B6lmg/L、維生素C2mg/L。
[0035] 表1不同的激素配比對'紅顏'果實愈傷組織的誘導的影響
[0036]
[0037] 從試驗結果可以得知，培養基中添加6-BA和NAA的濃度分別是0. 4mg/L和0. 2mg/ L時，產生的愈傷組織大小適中，組織緊密。顏色黃白色，組織分化能力強，愈傷組織誘導率 達到100%，是最合適的果實愈傷組織誘導激素配比。
[0038] (2)將草莓'紅顏'的三個不同生長時期：花后5-8天、15-18天、23-25、28-30的果 肉分別接種于MS培養基、6-BAO. 4mg/L、NAAO. 2mg/L、蔗糖20g/L、瓊脂粉6g/L的培養基上 研究不同的果實生長時期對草莓'紅顏'果實愈傷組織誘導的影響。
[0039] 表2草莓果實的不同生長時期對'紅顏'果實愈傷組織的誘導的影響
[0040]
[0041] 果實的不同生長時期對愈傷組織的誘導有很大的影響，從試驗結果可以看出，花 后5~8天的果實比較容易誘導愈傷組織，誘導率達到100%。草莓在花后5~8天果實發 育非常小，但是因為草莓果實整個發育期只有30-35天，因此，只能選擇非常幼小的果實來 培養愈傷組織，如果果實發育8天以后，愈傷組織都會長得非常疏松，不利于后期實驗。
[0042] (3)將草莓'紅顏'的果肉接種于MS培養基、6-BAO. 4mg/L、NAA0. 2mg/L、蔗糖20g/ L、瓊脂粉6g/L的培養基上，一部分在光照環境下培養，一部分在完全遮光的黑暗條件下培 養，研究光照和暗培養對草莓'紅顏'果實愈傷組織誘導的影響。
[0043] 表3果實的不同生長時期對'紅顏'果實愈傷組織的誘導的影響
[0044]
[0045] 果實的愈傷組織培養不同于葉片或者其他外植體愈傷組織，需要在完全黑暗的條 件下培養，在試驗中，如果按照我們平時普通外植體愈傷培養的條件培養果實愈傷，得到的 愈傷不僅質量差，而且愈傷誘導率非常低。而在完全黑暗條件下培養的愈傷，誘導率可以達 到100 %，遇上質量也很好，因此，果實愈傷培養不需要光照。
【主權項】
1. 一種草莓果實愈傷組織的培養方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 草莓果實的無菌化處理 果實表面用流水沖洗干凈，在無菌條件下，用75%的乙醇消毒2分鐘后用無菌去離子水 沖洗3次，然后用10%的次氯酸鈉消毒8分鐘，再用無菌去離子水沖洗4~5次，然后用無菌 濾紙吸干果皮表面水分；消毒完成后用無菌的手術刀片小心削去果皮，從果實中間切開，選 取果心部分，用打孔器切直徑0. 5厘米的圓片接種于愈傷誘導培養基上； (2) 草莓果實的圓片培養 在沒有光照的黑暗培養箱中25°C培養5天后，果實原片周圍會有不規則形狀的愈傷組 織長出，這時在無菌條件下切下果肉邊緣的愈傷接種于培養基中進行愈傷組織增殖，培養 1〇~15天以后，愈傷體積變為原來體積的3~4倍大小。2. 根據權利要求1所述的草莓果實愈傷組織的培養方法，其特征在于：所述培養基為 MS培養基，每升MS培養基中包括6-BAO. 4mg/L、NAA0. 2 mg/L、蔗糖20g/L、瓊脂粉6g/L。3. 根據權利要求2所述的草莓果實愈傷組織的培養方法，其特征在于：每升MS培 養基包括：KNO3硝酸鉀 1500 mg/L、（NH4)2SO4硫酸銨 500 mg/L、CO (NH2)2尿素 200 mg/L、 MgSO4 ? 7H20 七水合硫酸鎂 400 mg/L、KH2PO4磷酸二氫鉀 200mg/L、KI 碘化鉀 I. I mg/L、 MnSO4 ? 4H20四水合硫酸錳20 mg/L、ZnSO4 ? 7H20七水合硫酸鋅8 mg/L、氏803硼酸5 mg/L、 Fe-EDDHA乙二胺鄰二羥基乙酸鐵10 mg/L、CaCl2 ? 2H20二水合氯化鈣100 mg/L、肌醇100 mg/L、煙酸 2 mg/L、維生素 B1Img/!^ 維生素 B6I mg/L、維生素 C2 mg/L。4. 根據權利要求2所述的草莓果實愈傷組織的培養方法，其特征在于：所述培養基的 PH值為5. 8。5. 根據權利要求1所述的草莓果實愈傷組織的培養方法，其特征在于：選用生長時期 為花后5~8天的草莓作為培養對象。
【專利摘要】本發明公開了一種草莓果實愈傷組織的培養方法，首先將草莓果實無菌化處理，在沒有光照的黑暗培養箱中25℃培養5天后，果實原片周圍會有不規則形狀的愈傷組織長出，這時在無菌條件下切下果肉邊緣的愈傷接種于愈傷組織增殖培養基中，培養10~15天以后，愈傷體積變為原來體積的3~4倍大小。本發明提供了一種草莓果實愈傷組織的培養方法，果實愈傷組織誘導率可達到100%，草莓的分子生物學以及基因工程研究提供了一條新的途徑，為草莓基因工程研究和基因轉化提供一種新的試驗材料，同時也為草莓果實愈傷的培養提供了參考和借鑒。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105165611
【申請號】
【發明人】王媛花, 張立偉, 顏志明, 王全智
【申請人】江蘇農林職業技術學院
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月22日