最高，可達 90. 00%，愈傷組織生長量最好，顏色和質地最佳（圖2)。分析得出此培養基為：3/4MS+TDZ 1. 5mg/L+麥芽糖2% +瓊脂1%，PH調為5. 8,置于溫度28±1°C的溫室培養箱中弱光培養14d。求出每個組合出愈率的平均值，分析同時得出最佳組合為：3/4MS+TDZ1.5mg/L+麥芽 糖2% +瓊脂1%，pH5. 8,溫度28±1°C，黑暗條件培養。四種因素對冬棗葉片愈傷組織影 響的主次順序為B>D>C>A，即激素TDZ的影響最大，光照條件次之，碳源麥芽糖再次，培養基 3/4MS最小。
[0095] 2. 4優化冬棗葉片愈傷組織誘導條件
[0096] 根據正交實驗得出的最優組合：3/4MS+TDZ1. 5mg/L+麥芽糖2%+瓊脂1%，黑 暗條件培養，設置TDZ濃度lmg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2. 5mg/L四個梯度處理，pH5.8,溫度 28±1°C，暗培養14天，具體方法是：
[0097] 將20天葉齡，取自葉基部向上第3-4葉作為外植體，用無菌水浸泡lOmin，于超凈 工作臺內用70%的酒精進行表面消毒30-60s，無菌水沖洗2-3次，再用20%次氯酸鈉溶液 進行消毒5min，無菌水沖洗3-5次，然后將消毒后的外植體用經高壓蒸汽滅菌的手術刀將 材料進行切割，將切割好的材料轉接到錐形瓶，輕輕插入或放在培養基的表面。錐形瓶中的 培養基分別為：
[0098]A、3/4MS+TDZlmg/L+麥芽糖 2% + 瓊脂l%，pH5.8。即每升含有TDZlmg、麥芽糖 20g、瓊脂10g、余量為3/4MS培養基，配制方法是將TDZlmg、麥芽糖20g、瓊脂10g溶解于 1L3/4MS培養基中，滅菌備用，以下培養基按照此方法配制。
[0099]B、3/4MS+TDZ1. 5mg/L+ 麥芽糖 2% + 瓊脂1%，pH5. 8。
[0100] C、3/4MS+TDZ 2. 0mg/L+麥芽糖 2 % + 瓊脂 1 %，pH5. 8。
[0101]D、3/4MS+TDZ2. 5mg/L+麥芽糖 2%+ 瓊脂1%，pH5. 8。
[0102] 每個錐形瓶中接種4-5個，保證其有充分的空間生長。然后置于溫度28±1°C，暗 培養14d，愈傷組織無褐變和玻璃化等問題。統計愈傷組織誘導情況如表2. 3
[0103] 表2. 3冬棗葉片愈傷組織優化組合
[0104]
[0105]
[0106] 注：?以上外植體材料均接種于3/4MS培養基麥芽糖2% +瓊脂1%，pH調為5. 8 的培養基上，黑暗培養14d后統計愈傷組織的增殖
[0107] 由表2. 3可知，TDZ為1.5mg/L時出愈率最高達到92. 00%，愈傷組織生長量最 大，顏色和質地最佳，驗證了正交實驗中得出的最優組合。當TDZ濃度為2mg/L時出愈率為 84. 00%，當濃度增加至2. 5mg/L時出愈率降為78. 00%，因此可以看出隨著TDZ濃度增加， 冬棗葉片出愈率不斷提高；當達到一定值后，出愈率隨著TDZ濃度的增加反而降低，TDZ起 抑制作用。繼續使用3/4MS+TDZ1. 5mg/L+麥芽糖2 % +瓊脂1 %，pH5. 8,溫度28 ± 1°C，光 照下培養，得到不定芽（見圖3)。
[0108] 外植體方面，以培養20天左右的自基部向上第3-4片幼嫩葉片作為材料，可以有 效提高愈傷組織誘導率。研究發現，以冬棗葉片作為外植體進行愈傷組織誘導，形成的愈傷 組織相對有些致密，出愈率明顯要高；而用頂芽、莖段作為外植體出愈率相對較低，愈傷組 織疏松、膨脹且易行成水漬狀。這些結果說明，與莖段相比，以葉片為外植體時，愈傷組織的 誘導和生長情況要好。
[0109] 植物激素對愈傷組織的誘導具有重要的調控作用。TDZ是誘導冬棗葉片愈傷組織 的重要激素。研究表明，隨著TDZ濃度的提高，冬棗葉片對愈傷組織的誘導能力逐漸增強， 但超過一定濃度時，反而對愈傷組織的誘導起抑制作用。實驗結果顯示，冬棗葉片愈傷組織 誘導最適的TDZ濃度為1. 5mg/L，這時冬率葉片脫分化的能力最強，細胞分裂最為旺盛。同 時，研究還發現，2, 4-D可以有效的誘導冬棗葉片形成愈傷織，如果用2, 4-D代替TDZ，也能 使冬棗葉片誘導出愈傷組織，但誘導率不如TDZ高。這表明，不同種類的植物，同一種植物 不同器官對不同類型的生長激素或細胞分裂素敏感程度是不一致的，因此具有一定的選擇 性。由于上述原因，最終確定TDZ為1. 5mg/L時，冬棗葉片的出愈率最高而且愈傷組織生長 狀況最好。
[0110] 此外，在實驗中，培養基中加入的糖類最好是麥芽糖，而加入蔗糖和葡萄糖的效果 并不太理想。原因可能有多個方面，可能是不同的植物對不同的糖類利用的能力不同，也可 能是麥芽糖更有利于維持擬葉片細胞的滲透壓，從而有利于細胞的生長和分裂。
[0111] 而在實驗的過程中，發現用三角瓶培養外植體時，愈傷組織的生長狀況比較好，并 且出愈率高，很可能是因為與培養皿相比，三角瓶的通氣效果更好，有利于提高培養基中〇 2 的含量；另一方面，也可能是由于三角瓶的保濕能力要強于培養皿，有利于維持培養基中水 分的含量。由于這些原因，三角瓶中的外植體誘導愈傷的效果要好于培養皿。
[0112] 冬棗作為濱州地區的特有果樹樹種，具有巨大的經濟價值和開發潛力。雖然在微 觀代謝及其分子機制的研究和其擴繁、育種、脫毒等眾多領域依然存在不少的理論和技術 難題，但無疑，對冬棗的葉片外植體進行組織培養，得其脫毒組培苗定然是解決上述諸多問 題的有效方法和途徑。相信隨著冬棗葉片愈傷組織體外誘導、增殖及分化技術和培養體系 的改進和完善，輔之以基因工程及細胞工程等現代生物學手段，我們定能攻克一個個理論 及技術難題，充分發掘及利用冬棗的種質潛力，從而創造巨大的經濟及社會價值！這對于 今后植物細胞的遺傳轉化，相關基因功能的研究，植物性狀的改良，細胞的大規模培養以及 次生代謝產物的生產都具有相當重要的價值和意義。
【主權項】
1. 一種沾化冬棗葉片愈傷組織的培養方法，其特征在于，包括以下步驟： 選擇沾化冬棗水培苗20天葉齡，取自葉基部向上第3-4葉作為外植體，消毒后，接種于 誘導培養基上，然后置于溫度28 土rc，暗培養或弱光培養，得到冬棗葉片愈傷組織； 所述的誘導培養基，每升含有TDZI. 0~I. 5mg、麥芽糖20g、瓊脂10g，余量為3/4MS培 養基，pH5. 8。2. 根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述的誘導培養基，每升含有IDZ I. 5mg、麥芽糖20g、瓊脂10g，余量為3/4MS培養基，pH5. 8,然后置于溫度28± 1°C，暗培養， 得到冬棗葉片愈傷組織。3. 根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述的消毒為將外植體用無菌水浸 泡lOmin，于超凈工作臺內用體積分數70%的酒精進行表面消毒30-60S，無菌水沖洗2-3 次，再用體積分數20%次氯酸鈉溶液進行消毒5min，無菌水沖洗3-5次。4. 根據權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述的弱光培養是在5001UX光照下 進行培養。
【專利摘要】本發明公開了一種沾化冬棗葉片愈傷組織的培養方法。選擇沾化冬棗20天葉齡，取自葉基部向上第3-4葉作為外植體，消毒后，接種于誘導培養基上，然后置于溫度28±1℃，暗培養或弱光培養，得到冬棗葉片愈傷組織；所述的誘導培養基，每升含有TDZ？1～1.5mg、麥芽糖20g、瓊脂10g，余量為3/4MS培養基，pH5.8。按照本發明的方法能夠高效的獲得沾化冬棗葉片愈傷組織，其出愈率高達85％以上，并且無褐變和玻璃化等問題，從而為獲得組培苗，實現優良株系的無性快繁，建立一個高效穩定的葉片再生體系，同時也為基因工程操作提供優良的實驗材料和遺傳轉化體系的建立奠定基礎。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105165613
【申請號】
【發明人】劉雪紅, 姚志剛, 劉京濤, 王寶琴
【申請人】濱州學院
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月24日