一種卷萼兜蘭組培快繁方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物組織培養研究領域，具體涉及一種卷萼兜蘭組培快繁方法。
【背景技術】
[0002]卷萼5?蘭(Paph1pedilumappletonianum (Gower)Rolfe)屬蘭科5?蘭屬，是多年生草本植物，主要分布于我國海南省、廣西省南部，越南、老撾、柬埔寨和泰國也有分布，生于海拔300-1200米的林下陰濕、酸性砂巖面的腐葉土上，在12?30°C溫度范圍內均能生長。卷萼兜蘭葉片矩圓狀橢圓形，上面有深淺綠色相間的網格斑，花形奇特，花色美麗，花期長，養護管理簡單，頗受消費者喜愛，具有極高的觀賞價值和較高的經濟價值，是發展盆栽花卉產業的新興品種，也是優良的育種親本，市場需求潛力巨大。
[0003]目前，兜蘭屬所有野生種類都被列為國家一級保護植物，卷萼兜蘭的野生資源由于連年過量采挖和環境破壞，種群數量逐年減少，亟待采取保護措施，以保護其種質資源和野生種群。卷萼兜蘭一般采用分株繁殖和種子繁殖的方法，但存在繁殖系數低、成活率不高等問題，利用組培方法可有效保護野生資源，但至今卷萼兜蘭的組培快繁技術并未獲得成功，從而制約了其規模化商業生產。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于解決現有技術存在的問題，利用植物組培快繁的方法獲得大量優質卷萼兜蘭種苗，采用的技術方案如下:
1.一種卷萼兜蘭組培快繁方法，其特征在于包括以下步驟:
(1)外植體滅菌:人工授粉130d后，采集未開裂、飽滿的蒴果作為外植體，用75%酒精滅菌20s，0.1%升萊滅菌lOmin，無菌水沖洗6次，再用0.1%升萊第二次滅菌3min，無菌水沖洗6次，用無菌濾紙吸干表面水分；
(2)種子萌發培養:將滅菌后的蒴果在無菌條件下切開，將種子均勻撒播在種子萌發培養基上，光照培養40?45d，種子發育成原球莖，所述的種子萌發培養基為VW+6-BA0.1?
0.3mg/L+NAA0.1 ?0.3mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(3)增殖培養:將原球莖轉接到增殖培養基，光照培養55?60d得到類原球莖和芽的混合體，所述的增殖培養基為:l/2MS+6-BAl.0 ?2.5mg/L+NAA0.5 ?0.8mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(4)分化培養:將增殖培養得到的混合體轉接到分化培養基，光照培養45?55d得到具有2?3片葉的小苗，所述的分化培養基為:l/2MS+6-BA0.2?0.5mg/L+NAA0.6?0.9mg/L+KT0.4 ?0.7mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(5)生根培養:將小苗轉入生根培養基，光照培養55?60d得到高4?5cm的試管苗，所述的生根培養基為:1/2MS+IBA0.2 ?0.5mg/L+NAA0.8 ?1.0mg/L+ 蛋白胨 2.0g/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(6)煉苗移栽:挑選生長健壯、根系長至2?3cm的試管苗，帶瓶移至常溫、無直射光環境下，煉苗10?15d，取出試管苗，用清水洗凈培養基，移栽到苗床基質中，環境要求通風良好，遮光70%?75%，空氣相對濕度75%?80%，溫度15?28°C，15?20d試管苗即可成活；
2.前述的一種卷葉兜蘭組培快繁方法，其特征在于，步驟(6)所述的苗床基質鋪設方法為:苗床下層鋪5?7cm厚的粗砂，上層鋪8?1cm厚的腐葉土。
[0005]本發明的有益效果體現在:實現了卷萼兜蘭的組織培養和快速穩定繁殖，得到的再生植株性狀穩定、苗齊、苗壯，豐面頰；分化率達80%以上，生根率達88%以上，移栽成活率達95%以上，能夠進行大規模商品化育苗生產，對于這一珍貴野生種質資源的保護及其開發利用具有重要意義。
【具體實施方式】
[0006]實施例1
一種卷萼兜蘭組培快繁方法，包括以下步驟:
(1)外植體滅菌:當卷萼兜蘭的花冠剛展開時，去除唇瓣，將雄蕊上的花粉粒取下，涂到雌蕊柱頭上完成人工授粉，授粉130d后，采集未開裂、飽滿蒴果作為外植體，用75%酒精滅菌20s，0.1%升萊滅菌lOmin，無菌水沖洗6次，再用0.1%升萊第二次滅菌3min，無菌水沖洗6次，吸干表面水分，備用；
(2)種子萌發培養:將滅菌后的蒴果在無菌條件下切開，將種子均勻撒播在種子萌發培養基上，光照培養40?45d，種子發育成原球莖，所述的種子萌發培養基為VW+6-BA0.1mg/L+NAA0.lmg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(3)增殖培養:將原球莖轉接到增殖培養基，光照培養55?60d得到類原球莖和芽的混合體，所述的增殖培養基為:l/2MS+6-BAl.0mg/L+NAA0.5mg/L+ACl.0g/L+蔗糖 20g/L+瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(4)分化培養:將增殖培養得到的混合體轉接到分化培養基，光照培養45?55d得到具有2?3片葉的小苗，分化率為85%，所述的分化培養基為:l/2MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.6mg/L+KT0.4mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(5)生根培養:將小苗轉入生根培養基，光照培養55?60d得到高4?5cm的試管苗，生根率為92%，所述的生根培養基為:1/2MS+IBA0.2mg/L+NAA0.8mg/L+蛋白胨2.0g/L+AC1.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(6)煉苗移栽:挑選生長健壯、根系長至2?3cm的試管苗帶瓶移至常溫、無直射光條件下，煉苗10?15d，取出試管苗，用清水洗凈培養基，移栽至苗床的腐葉土中，所用苗床下層鋪有5?7cm厚的粗砂，有利于排水和透氣，上層鋪有8?1cm厚的腐葉土，卷萼兜蘭為淺根性植物，根系垂直分布的深度范圍是O?8cm，栽培環境要求通風良好，遮光70%?75%，空氣相對濕度75%?80%，溫度15?28 °C，15?20d試管苗即可成活，移栽成活率達98% ;
(7)培養室光照培養條件為:溫度25±2°C，光照10?12h/d，光照強度1100?1400LX。
[0007]實施例2
一種卷萼兜蘭組培快繁方法，包括以下步驟:
(I)外植體滅菌:人工授粉130d后，采集未開裂、飽滿的蒴果作為外植體，用75%酒精滅菌20s，0.1%升萊滅菌lOmin，無菌水沖洗6次，再用0.1%升萊第二次滅菌3min，無菌水沖洗6次，用無菌濾紙吸干表面水分；
(2)種子萌發培養:將滅菌后的蒴果在無菌條件下切開，將種子均勻撒播在種子萌發培養基上，光照培養40?45d，種子發育成原球莖，所述的種子萌發培養基為VW+6-BA0.3mg/L+NAA0.3mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
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