)增殖培養:將原球莖轉接到增殖培養基，光照培養55?60d得到類原球莖和芽的混合體，所述的增殖培養基為:l/2MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.8mg/L+ACl.0g/L+蔗糖 20g/L+瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(4)分化培養:將增殖培養得到的混合體轉接到分化培養基，光照培養45?55d得到具有2?3片葉的小苗，分化率為80%，所述的分化培養基為:l/2MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.9mg/L+KT0.7mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(5)生根培養:將小苗轉入生根培養基，光照培養55?60d得到高4?5cm的試管苗，生根率為 90%所述的生根培養基為:1/2MS+IBA0.5mg/L+NAAl.0mg/L+蛋白胨 2.0g/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(6)煉苗移栽:挑選生長健壯、根系長至2?3cm的試管苗帶瓶移至常溫、無直射光條件下，煉苗10?15d，取出試管苗，用清水洗凈培養基，移栽至苗床的腐葉土中，所用苗床下層鋪5?7cm厚的粗砂，上層鋪8?1cm厚的腐葉土，栽培環境要求通風良好，遮光70%?75%，空氣相對濕度75%?80%，溫度15?28°C，15?20d試管苗即可成活，移栽成活率達95% ；
(7)培養室光照培養條件為:溫度25±2°C，光照10?12h/d，光照強度1100?1400LX。
[0008] 實施例3
一種卷萼兜蘭組培快繁方法，包括以下步驟:
(1)外植體滅菌:人工授粉130d后，采集未開裂、飽滿的蒴果作為外植體，用75%酒精滅菌20s，0.1%升萊滅菌lOmin，無菌水沖洗6次，再用0.1%升萊第二次滅菌3min，無菌水沖洗6次，用無菌濾紙吸干表面水分；
(2)種子萌發培養:將滅菌后的蒴果在無菌條件下切開，將種子均勻撒播在種子萌發培養基上，光照培養40?45d，種子發育成原球莖，所述的種子萌發培養基為VW+6-BA0.2mg/L+NAA0.2mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(3)增殖培養:將原球莖轉接到增殖培養基，光照培養55?60d得到類原球莖和芽的混合體，所述的增殖培養基為:l/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.7mg/L+ACl.0g/L+蔗糖 20g/L+瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(4)分化培養:將增殖培養得到的混合體轉接到分化培養基，光照培養45?55d得到具有2?3片葉的小苗，分化率為82%，所述的分化培養基為:l/2MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.7mg/L+KT0.5mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(5)生根培養:將小苗轉入生根培養基，光照培養55?60d得到高4?5cm的試管苗，生根率為88%，所述的生根培養基為:1/2MS+IBA0.3mg/L+NAA0.9mg/L+蛋白胨2.0g/L+AC1.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ;
(6)煉苗移栽:挑選生長健壯、根系長至2?3cm的試管苗帶瓶移至常溫、無直射光條件下煉苗10?15d，取出試管苗，用清水洗凈培養基，移栽至苗床的腐葉土中，所用苗床下層鋪5?7cm厚的粗砂，上層鋪8?1cm厚的腐葉土，栽培環境要求通風良好，遮光70%?75%，空氣相對濕度75%?80%，溫度15?28°C，15?20d試管苗即可成活，移栽成活率達97% ；
(7)培養室光照培養條件為:溫度25±2°C，光照10?12 h/d，光照強度1100?1400LX。
[0009]最后應說明的是:以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解:其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明實施例技術方案的精神和范圍。
【主權項】
1.一種卷萼兜蘭組培快繁方法，其特征在于包括以下步驟: (1)外植體滅菌:人工授粉130d后，采集未開裂、飽滿的蒴果作為外植體，用75%酒精滅菌20s，0.1%升萊滅菌lOmin，無菌水沖洗6次，再用0.1%升萊第二次滅菌3min，無菌水沖洗6次，用無菌濾紙吸干表面水分； (2)種子萌發培養:將滅菌后的蒴果在無菌條件下切開，將種子均勻撒播在種子萌發培養基上，光照培養40?45d，種子發育成原球莖，所述的種子萌發培養基為VW+6-BA0.1?0.3mg/L+NAA0.1 ?0.3mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ; (3)增殖培養:將原球莖轉接到增殖培養基，光照培養55?60d得到類原球莖和芽的混合體，所述的增殖培養基為:l/2MS+6-BAl.0 ?2.5mg/L+NAA0.5 ?0.8mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ; (4)分化培養:將增殖培養得到的混合體轉接到分化培養基，光照培養45?55d得到具有2?3片葉的小苗，所述的分化培養基為:l/2MS+6-BA0.2?0.5mg/L+NAA0.6?0.9mg/L+KT0.4 ?0.7mg/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ; (5)生根培養:將小苗轉入生根培養基，光照培養55?60d得到高4?5cm的試管苗，所述的生根培養基為:1/2MS+IBA0.2 ?0.5mg/L+NAA0.8 ?1.0mg/L+ 蛋白胨 2.0g/L+ACl.0g/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 6g/L，PH 為 6.5 ?7.2 ; (6)煉苗移栽:挑選生長健壯、根系長至2?3cm的試管苗，帶瓶移至常溫、無直射光環境下，煉苗10?15d，取出試管苗，用清水洗凈培養基，移栽到苗床基質中，環境要求通風良好，遮光70%?75%，空氣相對濕度75%?80%，溫度15?28°C，15?20d試管苗即可成活。2.根據權利要求1所述的一種卷葉兜蘭組培快繁方法，其特征在于，步驟(6)所述的苗床基質鋪設方法為:苗床下層鋪5?7cm厚的粗砂，上層鋪8?1cm厚的腐葉土。
【專利摘要】本發明公開了一種卷萼兜蘭組培快繁方法，屬于植物組織培養研究領域。包括如下步驟：（1）外植體滅菌，（2）種子萌發培養，（3）增殖培養，（4）分化培養，（5）生根培養，（6）煉苗移栽。本方法實現了卷萼兜蘭的組織培養和快速穩定繁殖，得到的再生植株性狀穩定、苗齊、苗壯，生根率達88%以上，移栽成活率達95%以上，能夠進行大規模商品化育苗生產，對于這一珍貴野生種質資源的保護及其開發利用具有重要意義。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105165622
【申請號】
【發明人】張桂玲, 溫四民
【申請人】臨沂大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月12日