一種測定光照影響植物選擇性吸收氮源的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生態學研究方法領域，尤其涉及一種測定光照影響植物選擇性吸收氮 源的方法。
【背景技術】
[0002] 土壤中包含多種含氮的化合物，如無機氮、氨基酸、多肽及蛋白質，除無機氮外， 氨基酸也可以作為植物生長的重要氮源。Chapin等（1993)首次發現無菌根的維管植物 喜歡吸收氨基酸，北極苔原無菌根植物白羊毛胡子草吸收氨基酸的量至少占總吸收氮量的 60%，且在以氨基酸為唯一氮源培養時吸收的氮及形成的生物量均比以無機氮為氮源時要 多。諸多研究者通過根系短期吸收試驗、實驗室有機氮源無菌培養試驗、野外植物對同位素 標記有機物質（ 13C，15N雙標記）的吸收及植物組織的15N自然豐度等方法，表明許多植物可 以吸收利用環境介質中的多種氨基酸、簡單蛋白質等有機氮化合物，而無需將有機氮轉化 為無機氮才能被植物吸收利用。
[0003] 自然界中諸如土壤類型、溫度、濕度、光照強度、pH、C02濃度及N水平等生態環境 因子能夠影響土壤有機氮的生物有效性.Warren等研究發現高山以及北極地帶植物在低 溫條件下優先吸收有機氮（如Gly)，在高溫條件下優先吸收無機氮。Baligar等也報道光 照強度通過光和作用影響豆科作物有機質和生物量的積累，進而影響豆科植物的生長和養 分的吸收。Xu等發現光照強度對Gly和NH4+的吸收無顯著影響，但可通過改變玉米根系形 態及其與根際微生物的競爭關系進而影響植物對有機氮的吸收。水稻、番茄等作物上已經 證實高濃度C02會增加分蘗數、根/冠、光和作用、植物生物量以及植物氮吸收量和微生物 固氮量，同時還具有高產優質效果。Godlewski等以15種農田和野生型植物為供試材料， 在無菌條件下研究它們對有機氮的吸收及其環境適應機制，發現所有植物根系都能夠分泌 蛋白水解酶，其分泌量與根系形態、根際環境緊密相關。此外，很多研究發現在不同水平外 源有機氮條件下，氨基酸態氮對植物氮素營養貢獻與無機氮（銨態氮、硝態氮）相當，甚至 大于無機氮。不同植物物種能夠形成自己獨特的適應機制，進而加強對根際環境中的氨基 酸吸收。
[0004] 光照強度是影響植物生長的最重要的環境因子之一，對不同氮源的選擇性吸收具 有重要的影響。光照強度隨著地區變化而存在著巨大的差異，從極地地區到赤道地區平均 光照強度逐漸升高，且光照強度在一天中也變化較大。溫度較高的地帶，光照強度一般較 高，但也有例外，如高山環境，海拔越高，溫度越低，而光照強度卻逐漸升高.光照為植 物生長提供能量與碳骨架，碳代謝與氮素代謝與吸收緊密相連。因此研究光照強度對植物 吸收有機氮具有重要的生態學意義。然而，氨基酸在自然狀態下會被微生物迅速分解，一定 程度上限制了氨基酸營養的研究。因此，長期的無菌環境是研究氨基酸代謝生理及環境因 素影響氮源選擇性吸收的重要基礎。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種測定光照影響植物選擇性吸收氮源的方法，通過以下步 驟實現： (1) 無菌苗的培育：選取飽滿的植物種子，在常溫下浸泡12h，之后依次采用70%酒精 浸泡1分鐘、無菌水沖洗3次、10%過氧化氫浸泡5分鐘、無菌水沖洗3次、0.lmolL1氯 化汞浸泡5分鐘、無菌水沖洗5次的滅菌方法，之后再將滅菌后的種子放置于已高壓滅菌 的培養皿中發芽3-5天，待植物根系生長至約lcm，將一粒種子放置于已滅菌的裝滿0. 5% 瓊脂的50ml離心管中，置于無菌培養臺上培養1-3天，植物通過離心管蓋子中心的直徑 為0. 3cm的小孔長出，采用南大704硅橡膠密封小孔，該硅膠較軟，不會限制植物的生長， 待硅膠定型后（2h左右)，添加含 4mmolLiCaClp〗mmol1^1(2504，、2mmol 1. 4 mmol L MgSC^ ? 7H20、0. 1 y mol L iNaMoC^ ? 2H20、0. 4 y mol L iCuSC^ ? 5H20、1 y mol LVnSO^THW'S ymol LABOrlO ymol I^MnClpS ymol L'NafDTA 和 18.3 ymol L肀以04 ? 7H20的營養液，試驗中所用器具及營養液均采用高溫高壓滅菌，各氮源采用過 0. 22ym濾膜滅菌； (2) 長期光照強度對植物選擇性吸收氮源的影響：供試氮源為N03、NH/、甘氨酸，三種 氮源（N03、NH/、甘氨酸）等氮量混合，總濃度為3mM，且每次只標記其中一種氮源(標記物 豐度值為50.22 &七％15勵3、50.17 3七％15順4+、50.16 3七％1%-甘氨酸)，光照強度設36、 162、288、414、540iimolm2s1五個梯度，共15個處理，采用離光源距離的遠近來控制光照 強度，每種光照強度處理設置一空白，以檢測自然豐度，每三天更換一次營養液，培養25天 后，測定植物地上部及根系的生物量及 15N豐度； (3) 短期特定光照強度對植物吸收氮源的影響： 以3mM硝酸鈉+0. 5mM硫酸銨+0. 5mM甘氨酸為氮源，采用步驟（1)方法無菌培養植物 25天，該氮源配比下植物根系生長旺盛，以達到檢測對樣品質量的要求，取長勢基本一致的 植物幼苗，采用無菌水將離心管及植物根系多次沖洗，放置在無菌水中"饑餓"培養一整夜 (約l〇h)，將植物放置于含3mM 98.10 at.% 15N-甘氨酸的溶液中，設90、360、540 y mol m 2 s1三個光照強度處理，吸收4h后破壞性采樣； (4) 短期特定光照強度對植物吸收氮源方式的影響： 以3mM硝酸鈉+0. 5mM硫酸銨+0. 5mM甘氨酸為氮源，采用步驟（1)方法無菌培養植物25 天，該氮源配比下植物根系生長旺盛，以達到檢測對樣品質量的要求，取長勢基本一致的植 物幼苗，采用無菌水將離心管及植物根系多次沖洗，放置在無菌水中"饑餓"培養一整夜(約 l〇h)，選取6株長勢一致的植物幼苗，將其根系預先放置于50 ymol L1 CCCP(protonphore carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone)溶液中1小時，使其根系失活，然后以不 用CCCP處理的幼苗做對照，將植物放置于含3mM 98. 10 at.% 15N-甘氨酸的溶液中，設90、 360、540 iimol m2 s1三個光照強度處理，進行標記氮源的短期吸收方式試驗，吸收4h后破 壞性采樣，CCCP處理根系后，限制了根系的主動運輸，其吸收的氮源均為被動吸收而來，而 未經CCCP處理則為主動吸收與被動吸收的總和； (5) 樣品處理： 經過長期吸收和短期吸收的植物樣品采收后，將地上部和地下部分開，植物根系先用 超聲波清洗，然后用0.5 mol L1 CaCl2清除吸附在根系表面的氮素，最后用無菌水沖洗干 凈，并用吸水紙吸干，植物根系和地上部樣品用凍干機冷凍干燥后，稱重，用球磨儀粉碎，樣 品高溫消煮氧化，全氮含量用半微量凱氏定氮儀蒸餾，最后用0.01molL1硫酸滴定，采用 同位素質譜儀測定植株不同部位的15N豐度值； (6)測定氮源： 植物對某一氮源的吸收是根據植物體內的15N含量來確定的，采用以下公式計算：
指的是植物根系或者地上部吸收某一氮源的量；4是植物根系或者地上部的 15N豐度值；疋指的是未添加標記氮源的15N空白豐度值；心是混合氮源中某一標記氮源的 豐度值，在步驟（2)的長期光照對植物吸收氮源的影響中，為50. 16% (甘氨酸）、50. 22% (勵3)、50.17%(順4+)，在步驟（3)、（4)的短期吸收中，為98.10%(甘氨酸）；:||_ #3^^ 指的是植物地上部或根系的總氮量。
[0006] 無菌環境是研究氨基酸營養的重要基礎，單一氮源標記的方法，是研究環境因子 對植物吸收混合氮源中特定氮素形態的有效方法，有效地將這兩種方法結合起來，就可以 準確且深入的研究環境因子尤其是光照強度對植物吸收特定氮源的影響。