大。而隨著光照強度的繼續增加，對小白菜生長有明顯的抑制作用。
[0025] 從圖2可以看出，光照對小白菜氮素吸收的影響與對生物量的影響相似，光照強 度與氮吸收的擬合方程為：y= -2E- 05x2 + 0.0151x+ 0.5961 (R2 = 0.946廣)，表明 小白菜吸收氮素的最適光照強度為360ymolm2s1。
[0026] 從圖3光照強度對不同氮源的吸收來看，甘氨酸態氮與硝態氮的吸收隨著光照強 度的增加而增加，直至414ymolmS1，而銨態氮在光照強度為414ymoln^s1的吸收 量卻顯著低于288和540ymolmb1。在相對較低的36ymolmb1光照強度下，硝態 氮的吸收量高于銨態氮的吸收量，而在相對較高的540ymolm2s1光照強度下，銨態氮的 吸收量要高于硝態氮。表明光照強度改變了小白菜對不同氮源的選擇性吸收。
[0027] 從圖4可以看出，在414ixmolmS1光強下，甘氨酸、硝態氮、銨態氮的營養貢獻 率分別為29. 8%、38. 9%、和31. 2%。在無菌環境下，甘氨酸的營養貢獻率為18-30%，表明 氨基酸可以作為植物生長的重要氮源。
[0028] 圖5表明光照強度對小白菜吸收甘氨酸的方式具有顯著的影響，高光照強度增加 了被動吸收的量，而在中等光照強度下主動吸收的量最大，低光照強度限制了主動和被動 吸收。
[0029] 從圖6可以看出，光照強度對小白菜地上部甘氨酸態氮量具有較大的影響，高光 照強度增加了被動吸收的量，而在中等光照強度下主動吸收的量最大，低光照強度限制了 主動和被動吸收。
[0030] 從圖7可以看出，光照強度對小白菜根系被動吸收甘氨酸態氮量具有較大的影 響，而對主動吸收無明顯影響。
[0031] 圖8表明，光照強度對被動吸收的甘氨酸向地上部的轉移具有顯著的影響，而對 根系被動吸收甘氨酸無顯著的影響，表明光照強度主要影響了被動吸收的甘氨酸向地上部 的轉移。
[0032] 綜上所述，光照強度對植物生長及對不同氮源的吸收均具有顯著的影響，低光照 下被動吸收顯著降低，過高光照強度下被動吸收增加。該發明公布的一種測定光照影響植 物選擇性吸收氮源的方法，結合了無菌培養與同位素標記的優勢，為研究環境因素對植物 吸收氮源的影響提供了方法基礎。
【主權項】
1. 一種測定光照影響植物選擇性吸收氮源的方法，其特征在于，通過以下步驟實現： (1) 無菌苗的培育：選取飽滿的植物種子，在常溫下浸泡12h，之后采用70%酒精浸泡 1分鐘-無菌水沖洗3次-10%過氧化氫浸泡5分鐘-無菌水沖洗3次-0.1mol L 1氯化萊 浸泡5分鐘-無菌水沖洗5次的滅菌方法，之后將滅菌后的種子放置于已高壓滅菌的培養 皿中發芽3-5天，待植物根系生長至約lcm，將一粒種子放置于已滅菌的裝滿0. 5%瓊脂的 50ml離心管中，置于無菌培養臺上培養1-3天，植物通過離心管蓋子中心的直徑為0. 3cm的 小孔長出，采用南大704硅橡膠密封小孔，待硅膠定型后添加營養液； (2) 長期光照強度對植物選擇性吸收氮源的影響：供試氮源為NO3、NH/、甘氨酸三 種，等氮量混合，總濃度為3mM，且每次只標記其中一種氮源，標記物豐度值為50. 22 at. % 15Ν03、50·17 at·% 15ΝΗ4+、50·16 at·% 15N-甘氨酸，光照強度為 36、162、288、414、540 ymol m 2 s 1五個梯度，共15個處理，采用離光源距離的遠近來控制光照強度，每種光照強度處理 設置一空白，以檢測自然豐度，每三天更換一次營養液，培養25天后，測定植物地上部及根 系的生物量及 15N豐度； (3) 短期特定光照強度對植物吸收氮源的影響：以3mM硝酸鈉+0. 5mM硫酸銨+0. 5mM甘 氨酸為氮源，采用步驟（1)方法無菌培養植物25天，取長勢基本一致的植物幼苗，采用無菌 水將離心管及植物根系多次沖洗，放置在無菌水中培養一整夜，將植物放置于含3mM 98. 10 at.% 15N-甘氨酸的溶液中，以90、360、540 μ mol m2 S1三個光照強度處理，吸收4h后破壞 性采樣； (4) 短期特定光照強度對植物吸收氮源方式的影響：以3mM硝酸鈉+0. 5mM硫酸銨 +0. 5mM甘氨酸為氮源，采用步驟（1)方法無菌培養植物25天，取長勢基本一致的植物幼苗， 用無菌水將離心管及植物根系沖洗，放置在無菌水中"饑餓"培養一整夜，選取6株長勢一 致的植物幼苗，將其根系預先放置于50 μ mol L 1 CCCP溶液中1小時，使其根系失活，然后 以不用CCCP處理的幼苗做對照，將植物放置于含3mM 98. 10 at.% 15N-甘氨酸的溶液中，以 90、360、540 μπι〇1 m2 S1三個光照強度處理，進行標記氮源的短期吸收方式試驗，吸收4h 后破壞性采樣； (5) 樣品處理：經過步驟（2)長期吸收和步驟（3)、（4)短期吸收的植物樣品采收后，將 地上部和地下部分開，植物根系先用超聲波清洗，然后用0.5 mol L1 CaCl2清除吸附在根 系表面的氮素，最后用無菌水沖洗干凈，并用吸水紙吸干，植物根系和地上部樣品用凍干機 冷凍干燥后，稱重，用球磨儀粉碎，樣品高溫消煮氧化，全氮含量用半微量凱氏定氮儀蒸餾， 最后用0.01 mol L1硫酸滴定，采用同位素質譜儀測定植株不同部位的15N豐度值； (6) 測定氮源： 植物對某一氮源的吸收是根據植物體內的15N含量來確定，采用以下公式計算：指的是植物根系或者地上部吸收某一氮源的量；4是植物根系或者地上部的 15N豐度值；4指的是未添加標記氮源的15N空白豐度值；為是混合氮源中某一標記氮源 的豐度值，在長期光照對植物吸收氮源的影響中，為50. 16%甘氨酸、50. 22% NO3、50. 17% NH4+，在短期吸收中，為98. 10%甘氨酸：指的是植物地上部或根系的總 氮量。2. 根據權利要求1所述的一種測定光照影響植物選擇性吸收氮源的方法，其特征 在于，步驟（1)所述的無氮營養液的組成為：4 mmol L1CaCl2^ mmol L 1K2SO4,、2 mmol L 1KH2PO4' I. 4 mmol L 1MgSO4 · 7Η20、0· 1 μ mol L 1NaMoO4 · 2Η20、0· 4 Mmol L 1CuSO4 · 5Η20、 I Mmol L 1ZnSO4 ·7Η20、8 μ mol L1H3BO3UO Mmol L1MnCl2J Mmol L 1Na2EDTA和 18. 3 Mmol L 1FeSO4 · 7Η20。3. 根據權利要求1所述的一種測定光照影響植物選擇性吸收氮源的方法，其特征在 于，步驟（4)中放置在無菌水中培養一整夜的時間為10小時。4. 根據權利要求1所述的一種測定光照影響植物選擇性吸收氮源的方法，其特征在 于，步驟（1)試驗中所用器具及營養液均采用高溫高壓滅菌，各氮源采用過0. 22 μ m濾膜滅 菌。
【專利摘要】本發明公布了一種測定光照影響植物選擇性吸收氮源的方法。本發明通過培育無菌苗、測定長期光照強度對植物選擇性吸收氮源的影響、短期特定光照強度對植物吸收氮源的影響、短期特定光照強度對植物吸收氮源方式的影響、樣品處理、結果計算等過程，深入分析光照強度對植物吸收銨態氮、硝態氮、氨基酸的影響，為研究未來環境變化對植物生長尤其是氮素吸收的影響提供了方法基礎。采用完全無菌的培養環境，可以深入分析氨基酸對植物的營養貢獻，采用同位素標記技術，可以有效準確的區分光照強度對植物吸收不同氮源的影響。
【IPC分類】A01G7/04, A01G7/00, A01H4/00
【公開號】CN105165624
【申請號】
【發明人】馬慶旭, 吳良歡
【申請人】浙江大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月15日