。將預處理的孢子體組織塊置于滅菌培養皿，加入滅菌海水(無菌海水添加200 μ molL 1KNOjP 20 μ molL 1KH2PO4,溫度控制在8_10°C )，海水沒過孢子體組織塊，等待孢子放散。顯微鏡檢查游孢子密度，直至在100倍顯微鏡下，當一個視野達到10?20個健康游孢子，將孢子體組織塊撈出。用300目篩絹過濾掉粘液和雜物，得到孢子水。將孢子水加入置有滅菌載玻片的培養皿中，孢子水剛剛沒過載玻片即可。將培養皿移至光照培養箱中黑暗過夜培養，溫度8-12 °C。
[0032]3.配子體培養。經黑暗過夜的培養皿，置于以下條件繼續進行培養:培養液為添加200 μ molL 1KNOjP 20 μ molL 1KH2PO^菌海水，溫度為8_12 °C，光照度為20-30 μ molm 2S \光周期為12:12h (L = D)0每隔2天更換培養液。
[0033]4.雌雄配子體分離。配子體在上述條件下培養7天后，每天鏡檢配子體發育情況，直至能從形態上區分雌雄配子體(圖1):雌配子體2通常為I個細胞，球形或梨形；雄配子體I通常為多細胞，由數個至十幾個細胞不等，細胞個體明顯小于雌配子體。此時，將配子體從載玻片上輕輕刮下進行懸浮培養，在顯微鏡下使用移液器或毛細管分離雌、雄配子體，雌、雄配子體分別進行培養。培養條件同步驟4中所述。
[0034]5.配子體克隆系長途運輸。取少量分別培養的雌雄配子體克隆3，轉移到培養管(圖2)，更換新鮮的培養液，將培養管置于保溫盒，配子體長途運輸過程中，及時檢查控溫器具，保證配子體所處的微環境不超過18°C。
[0035]6.配子體克隆系擴繁與保存。將經過長途運輸的配子體，轉移至培養瓶中，置于以下條件繼續進行培養:培養液為添加200 μ molL 1KNOjP 20 μ molL 1KH2PO4滅菌海水，溫度為8-12°(:，光照度為20-3(^1110111128 \光周期為12:12h(L = D)0每隔I周更換培養液。
[0036]7.配子體克隆系長期保存:經一個月培養后，將配子體克隆系分為兩份，二者互為備份(圖3)，置于以下條件進行長久保存:培養液為添加氮磷營養鹽的滅菌海水(其成分及終濃度為200 μ mo IL 1KNO3^P 20 μ mo IL 1KH2PO4)，溫度為0_4 °C，光照度為不高于
5μ molm 2S \光周期為12:12h(L:D)，培養液更換頻率為6個月I次。
[0037]以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；本實施例的技術方案不僅適用于極北海帶，同樣適用于海帶屬的其它品種。盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。
【主權項】
1.一種基于配子體克隆系的海帶屬大型經濟褐藻引種方法，其特征在于它包括種藻選擇與預處理、孢子采集、配子體培養、雌雄配子體分離、配子體克隆系長途運輸、配子體克隆系擴繁和配子體克隆系長期保存，具體步驟如下: 1)種藻選擇與預處理選擇發育成熟的種藻，低溫取回并用無菌海水將種藻清洗干凈，進行陰干處理； 2)孢子采集將載有孢子囊的孢子體組織塊置于入滅菌海水中，使孢子放散，放散完畢后將孢子體組織塊撈出，過濾掉粘液和雜物，得到孢子水，將孢子水加入置有滅菌載玻片的容器中，孢子水剛沒過載玻片，黑暗過夜培養，溫度8-12°C ; 3)配子體培養經黑暗過夜的載玻片，置于以下條件繼續進行培養:培養液為添加氮磷營養鹽的滅菌海水，溫度為8-12°C，光照度為20-30 μ molm 2S \光周期為光照時間:黑暗時間=12:12h，每隔2天更換培養液； 4)雌雄配子體分離在步驟3)的條件下，配子體培養7天后，每天鏡檢配子體發育情況，待到能從形態上區分雌雄配子體時，分離雌、雄配子體，雌、雄配子體分別進行培養；培養條件同步驟3)中所述； 5)配子體克隆系長途運輸取少量步驟4)中培養的雌、雄配子體克隆，分別轉移到不同的培養管中，更換新鮮的培養液，將培養管置于保溫盒，保持溫度不高于18°C，進行長途運輸； 6)配子體克隆系擴繁將經過長途運輸的雌、雄配子體，分別轉移至不同培養容器中，置于以下條件繼續進行培養:培養液為添加氮磷營養鹽的滅菌海水，溫度為10-12°C，光照度為30-50 μ molm 2S \光周期為光照時間:黑暗時間=12:12h，每隔I周更換培養液； 7)配子體克隆系長期保存:經步驟6)的方法進行I月培養后，將配子體克隆系分為兩份，二者互為備份，置于以下條件進行長久保存:培養液為添加氮磷營養鹽的滅菌海水，溫度為0-4°C，光照度為不高于5 μ molm 2S \光周期為光照時間:黑暗時間=12:12h，培養液更換頻率為6個月I次，雌雄配子體分別培養。2.根據權利要求1所述的一種基于配子體克隆系的海帶屬大型經濟褐藻引種方法，其特征在于步驟I)所選擇種藻的標準為個體大、完整，顏色正常、具光澤，表面無其它附著生物，孢子囊飽滿的種藻。3.根據權利要求1所述的一種基于配子體克隆系的海帶屬大型經濟褐藻引種方法，其特征在于步驟I)所述的低溫為o-1o°c。4.根據權利要求1所述的一種基于配子體克隆系的海帶屬大型經濟褐藻引種方法，其特征在于步驟I)中的種藻選擇時，選取目標海藻生長茂盛的海區，在大潮退潮至最低線，在海藻群體中選擇種藻。5.根據權利要求1所述的一種基于配子體克隆系的海帶屬大型經濟褐藻引種方法，其特征在于步驟I)中的種藻孢子體陰干時，置于陰涼通風處，溫度控制在20°C以下，直至孢子體表面水分蒸干、藻體稍干燥為止。6.根據權利要求1所述的一種基于配子體克隆系的海帶屬大型經濟褐藻引種方法，其特征在于步驟2)在孢子體放散時，檢查游孢子密度，待游孢子的密度為在100倍顯微鏡下一個視野有10?20個時，撈出孢子體組織塊。7.根據權利要求1所述的一種基于配子體克隆系的海帶屬大型經濟褐藻引種方法，其特征在于所述步驟4)的雌雄配子體分離是在顯微鏡下使用移液器或毛細管分離。8.根據權利要求1所述的一種基于配子體克隆系的海帶屬大型經濟褐藻引種方法，其特征在于所述的添加氮磷營養鹽的滅菌海水，它的成分及其終濃度:KN03200 μ molL 1和KH2P0420 ymolL 1O
【專利摘要】一種基于配子體克隆系的海帶屬大型經濟褐藻引種方法，本發明屬于海洋生物技術領域，它包括種藻選擇與預處理、孢子采集、配子體培養、雌雄配子體分離、配子體克隆系長途運輸、配子體克隆系擴繁和配子體克隆系長期保存。本發明利用海帶屬海藻配子體世代體積小、易保存的特點，進行長途運輸，占用體積小，無需更換培養液，簡單易行，成功率可高達100％。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105165628
【申請號】
【發明人】劉福利, 王飛久, 孫修濤, 汪文俊, 梁洲瑞
【申請人】中國水產科學研究院黃海水產研究所
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月22日