配體修飾第一聚合物載體以及第二聚合物載體溶于水中，經超聲處理后加入透析袋透析，制備成粒徑為10?1000nm的核殼結構混合膠束。
[0018]作為上述技術方案的改進，所述的一種腫瘤靶向聚合物膠束的制備方法，還包括核殼結構混合膠束包載藥物的方法:
將所制得的對細胞膜成分磷脂酰乙醇胺具有親和力的靶向配體修飾第一聚合物載體以及第二聚合物載體溶于水中制得載體溶液，通過溶劑將藥物溶解后，滴加于所述載體溶液中，通過攪拌或超聲使之均勻分散后透析，再濾膜過濾，即得載藥膠束溶液。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發明所述的一種腫瘤靶向聚合物膠束的作用原理示意圖；
圖2為本發明所述的Dur-PEG-PDLLA的合成路線圖；
圖3為本發明所述的PEG-P(His)的合成路線；
圖4為本發明所述的蘭考韋泰的氫譜圖；
圖5為本發明所述的PEG-PDLLA的氫譜圖；
圖6為本發明所述的Dur-PEG-PDLLA的氫譜圖；
圖7為本發明所述的Dur-PEG-PDLLA的粒徑分布示意圖； 圖8為本發明所述的mPEG-NH2的氫譜；
圖9為本發明所述的PEG-P(His)的氫譜。
【具體實施方式】
[0020]下面將結合具體的實施例來說明本發明的內容。
[0021]下文所述PEG-PDLLA即為聚乙二醇和外消旋聚乳酸的共聚物，所述Dur-PEG-PDLLA即為蘭考韋泰作為靶向配體修飾的聚乙二醇和外消旋聚乳酸的共聚物。所述PEG-P (His)即為聚乙二醇和聚組氨酸的共聚物。
[0022]如圖1所示，為發明所述一種腫瘤靶向聚合物膠束的構建及釋藥過程示意圖。本發明所述一種腫瘤靶向聚合物膠束的制備方法，包括以下步驟:
一、Dur-PEG-PDLLA的制備，如圖2所示，包括以下步驟:
步驟1.1:將H00C-PEG-PDLLA (具體結構可見圖2，可以通過市售獲得)溶于N，N- 二甲基甲酰胺中，先加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(即EDC)反應一段時間后再加入交聯劑N-羥基琥珀酰亞胺(即NHS)，室溫攪拌48?72小時后，使羧基活化；得到PDLLA-PEG-CONHS (具體結構可見圖2)。
[0023]步驟1.2:將步驟1.1的最終反應液過濾后，向其中滴加溶解有蘭考韋泰的二甲基亞砜溶液，之后加入三乙胺調節pH值至7.4左右，室溫攪拌72小時，得澄清溶液。
[0024]步驟1.3:將步驟1.2最終獲得的溶液經透析袋(截留分子量為3500Da)透析24小時后，用孔徑0.22微米或0.45微米的聚醚砜濾膜過濾，得澄清透明溶液，在燈光下觀察有淡藍色乳光，冷凍干燥后得Dur-PEG-PDLLA (具體結構可見圖2)。
[0025]上述反應過程中所涉及的主要原料和產物的氫譜圖見圖4至圖6，根據上述方法獲得的Dur-PEG-PDLLA的粒徑分布情況見圖7。
[0026]二、PEG-P (His)的制備，如圖3所示，包括以下步驟:
步驟2.1:將Boc-His(Dnp)-OH ■ isopropanol即溶于異丙醇的N-(叔丁氧羰基)-1-(2，4- 二硝基苯基)-L-組氨酸溶解于1，4- 二氧六環中，加入氯化亞砜反應I小時，生成沉淀過濾，用1，4- 二氧六環及乙醚洗滌沉淀，將沉淀用硝基甲烷完全溶解后，加入足量無水乙醚重結晶，得到淡黃色固體Dnp-NCA ■ Hcl (具體結構可見圖3)。
[0027]步驟2.2:將步驟2.1制得的Dnp-NCA ■ Hcl用N，N- 二甲基甲酰胺溶解后加入碳酸鈉中和鹽酸，室溫攪拌I小時后，加入mPEG-NH2 ■ Hcl的N，N- 二甲基甲酰胺溶液減壓反應72小時后，離心后用微孔濾膜過濾得醬油色溶液，向其中加入乙醚后，靜置使其沉淀，抽濾后真空干燥，得到的棕色固體PEG-b-poly (Nim-Dnp-His)(具體結構可見圖3)。
[0028]步驟2.3:將步驟2.2制得的PEG-b-poIy (Nim-Dnp-His)加入N，N- 二甲基甲酰胺溶解后，加入β -巰基乙醇反應過夜，脫去2，4- 二硝基苯基將所得淡黃色溶液裝入透析袋(截留分子量為100Da)透析24小時，離心后用聚醚砜濾膜過濾，聚醚砜濾膜孔徑可以選用常用的0.22微米或0.45微米，濾液冷凍干燥后即獲得PEG-P (His)(具體結構可見圖3)。
[0029]上述反應過程中所涉及的主要原料和產物的氫譜圖見圖8和圖9。
[0030]三、將Dur-PEG-PDLLA和PEG-P (Hi s)制備成核殼結構混合膠束，其包括以下步驟:
將所制得的Dur-PEG-PDLLA以及PEG-P(His)溶于水中，經超聲處理后加入透析袋透析，制備成粒徑為10?1000 nm的以蘭考韋泰修飾的聚合物膠束。
[0031]四、所述核殼結構混合膠束包載藥物的方法包括以下步驟:
將難溶性藥物用適當溶劑(藥學上使用的能溶解該藥物的溶解)溶解，制得粒徑10?1000 nm的聚合物膠束。
[0032]具體地，以治療藥物紫杉醇或長春堿的包載為例:
將Dur-PEG-PDLLA和PEG-P (His)溶于水中，將紫杉醇或長春堿采用乙醇溶解后，滴加于載體溶液中，劇烈攪拌20分鐘，于冰下探頭超聲30分鐘，重蒸水透析過夜，通過0.22微米或0.45微米的濾膜過濾，即得載藥膠束溶液。
[0033]五、Dur-PEG-PDLLA和PEG-P (His)靶向性輸送能力的考察:
HELA細胞采用含10%胎牛血清DMEM培養基，37度5% C02，培養箱中培養，采用雙胸苷阻斷法同步化，具體做法:HELA細胞，DMEM培養基培養24小時，待細胞貼壁后加入胸苷(2mM/L)，繼續培養18小時，PBS洗滌三次，洗去胸苷，加新鮮DMEM培養基培養9小時，加入胸苷(2 mM/L)繼續培養17小時，磷酸鹽緩沖液洗滌三次，洗去胸苷(同步化Gl期)，加新鮮DMEM培養基繼續培養4小時(同步化S期)、10小時(同步化G2/M期)；
正常組細胞及不同時相HELA細胞分別加入包載熒光物質FITC的Dur-PEG-PDLLA、PEG-P(His)混合膠束和PEG-PDLLA、PEG-P (His)混合膠束(包載FITC的方法參考紫杉醇或長春堿的包載方法)，培養I小時后，細胞采用4%多聚甲醛固定，采用流式細胞儀分析不同組細胞攝取熒光強度。
[0034]結果Dur-PEG-PDLLA、PEG-P (Hi s)混合膠束組正常細胞組、同步化GI期組、同步化S期組、同步化G2/M期組平均熒光強度分別為37.3±5.2、23.6±3.9、26.4±6.6、72.7±13.4 ；
而PEG-PDLLA、PEG-P (His)混合膠束組正常細胞組、同步化Gl期組、同步化S期組、同步化 G2/M 期組平均熒光強度分別為 21.2±3.4、17.3±3.4、19.6±5.3,23.6±6.1。
[0035]結果表明:首先，PEG-P(His)具有針對腫瘤細胞組織的靶向輸送能力；其次，采用蘭考韋肽修飾PEG-PDLLA以后，相同條件下比未修飾PEG-PDLLA的攝取量顯著增加，并且采用蘭考韋肽修飾以后同步化G2/M期細胞攝取量顯著高于其它時相細胞攝取量，這與本申請采用蘭考韋肽修飾的特點是相關的。
[0036]在本發明中，PEG-PDLLA也可以采用其他類似的由親水段和疏水段組成的共聚物代替:如親水段還可以采用PEG (聚乙二醇)、PEO (聚環氧乙烷)、PVP (聚乙烯吡咯烷酮)、聚氨基酸、殼聚糖等，疏水段還可以采用PLLA (左旋聚乳酸)、PLG (聚乙醇酸)、PLGA (聚乳酸-羥基乙酸共聚物)、PCL ( ε_己內酯)、聚氨基酸等。
[0037]在本發明中，與蘭考韋泰類似對細胞膜成分磷脂酰乙醇胺具有親和力的靶向配體還可以是肉桂霉素、植物大環寡肽kalata BI等環肽。
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