份，加完后再以8000r/min攪拌10-15分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最終濃 度為萬分之一。
[0031] 半成品檢驗：按現行《中國獸藥典》附錄進行，應無菌生長。
[0032] 物理性狀：
[0033] 外觀乳白色乳劑。
[0034] 劑型油包水型。取一只清潔的吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，其余 均不擴散。
[0035] 穩定性吸取疫苗10ml加入尖底離心管中，以4000r/min分鐘離心15分鐘，管底 析出的水相應< 〇. 5ml，試驗結果為0. 05ml。將油乳劑放置在4°C、室溫、37°C環境觀察其破 乳情況見下表。
[0036] 油乳劑穩定性觀察
[0037]
[0038] 黏度用1ml吸管（下口內徑為1. 2mm，上口內徑為2. 7mm)，吸取25°C左右疫苗 lml，令其垂直自然流出，3組流出0. 4ml所需要時間分別為5. 0秒、4. 9秒、4. 8秒。
[0039] 用NDJ-5S旋轉粘度計測油乳劑粘度，平均值為40,粘度低。
[0040] 粒徑測試
[0041] 將水乳劑制備好后用LS-POP(6)激光粒度分布儀測定粒徑大小，結果如圖2所示， 粒徑小于500um，符合油乳劑粒徑要求。
[0042] 疫苗效力檢驗：取15只1月齡雞（HI效價=1:4)，其中10只皮下注射0.2ml疫 苗，另5只注射0. 2ml生理鹽水做對照。免疫后4周，每只雞肌肉注射l(f°EID50的強毒， 觀察14天，結果：對照組5只全部死亡，疫苗組10只存活9只，保護率90%。
[0043] 免疫抗體檢測：50只的肉種雞，10日齡每只皮下注射新城疫油乳劑滅活疫苗 0. 2ml，分別在免疫前和免疫后2周、3周、4周、2個月、4個月和6個月采20只雞血清，進 行HI抗體效價（log2)檢測。結果：HI抗體平均效價分別為3. 8、4. 7、7. 5、8. 2、7. 6、7. 0和 6.4。免疫保護期可達6個月以上。
[0044] 實施例2 :
[0045] 抗原制備：種毒為本單位分離鑒定的EDS-76病毒株。尿囊腔接種9-11日齡易感 鴨胚，收獲72-120小時死亡胚和120小時有病變活胚胚液，要求病毒胚液HA效價3 1012以 上，經甲醛溶液滅活后4°C保存備用。
[0046] 油相制備：將Span-80、甘露醇單油酸酯加入高壓滅菌的藥用白油混合，使其終濃 度分別為2. 4%和2. 5%，37°C水浴片刻，充分搖勻。
[0047] 水相制備：將一定比例的吐溫80、聚氧乙烯40氫化蓖麻油和蔗糖酯溶于抗原溶 液，使其占水相比例分別為2. 6%、2. 6%和1. 5%。
[0048] 乳化：取油相2份放于膠體磨內，開動電機慢速轉動攪拌，同時徐徐加入水相1 份，加完后再以8000r/min攪拌10-15分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最終濃 度為萬分之一，每羽份疫苗中減蛋綜合征病毒含量多2000HA單位。。
[0049] 半成品檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行，應無菌生長。
[0050] 物理性狀：
[0051] 外觀乳白色乳劑。
[0052] 劑型油包水型。取一只清潔的吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，其余 均不擴散。
[0053] 穩定性吸取疫苗10ml加入尖底離心管中，以4000r/min分鐘離心15分鐘，管底 析出的水相應< 〇. 5ml，試驗結果為0. 05ml。將油乳劑放置在4°C、室溫、37°C環境觀察其破 乳情況見下表。
[0054] 油乳劑穩定性觀察
[0055]
[0056] 黏度用1ml吸管（下口內徑為1. 2mm，上口內徑為2. 7mm)，吸取25°C左右疫苗 lml，令其垂直自然流出，3組流出0. 4ml所需要時間分別為4. 7秒、4. 8秒、4. 7秒。
[0057] 用NDJ-5S旋轉粘度計測油乳劑粘度，平均值為39,粘度低。
[0058] 粒徑測試
[0059] 將水乳劑制備好后用LS-P0P(6)激光粒度分布儀測定粒徑大小，結果如圖3所示， 粒徑小于500um，符合油乳劑粒徑要求。
[0060] 疫苗免疫抗體檢測：一群約100只的蛋雞，120日齡每只皮下注射雞減蛋綜合征油 乳劑滅活疫苗〇. 5ml，分別在免疫前和免疫后1周、2周、3周、4周、2個月、4個月、6個月、8 個月、12個月采20只雞血清，進行HI抗體效價（log2)檢測。結果：HI抗體平均效價分別 為0、1.4、5.5、8.5、10.2、9.4、8.7、8.1、7.6和6.1。免疫保護期可達12個月以上。
[0061] 以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術 人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變 化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其 等效物界定。
【主權項】
1. 一種油乳劑制備方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 、油相的制備：將Span-80、甘露醇單油酸酯按照體積按一定體積比例加入到經高 壓滅菌的藥用白油中混合，經37°C水浴充分搖勻； (2)、水相的制備：將吐溫80、聚氧乙烯40氫化蓖麻油和蔗糖酯按照一定的體積比例溶 于抗原溶液； (3) 乳化：按油相：水相=1. 5-2 : 1的體積比，先將油相放于膠體磨內，開動電機慢 速轉動攪拌，同時緩慢加入水相，加完后再以8000r/min攪拌10-15分鐘，在終止攪拌前加 入濃度為1 %的硫柳汞溶液，加入后其最終濃度為萬分之一； (4)、半成品檢驗； (5)、分裝：定量分裝，并粘貼標簽，置2~8°C保存。2. 根據權利要求1所述的一種油乳劑制備方法，其特征在于：所述的Span-80、甘 露醇單油酸酯、吐溫80、聚氧乙烯40氫化蓖麻油和蔗糖酯占疫苗總體積比例分別為 0? 1% -3. 5%、0. 1% -3. 5%、0.3%-2%、0. 3% -2% 和 0? 1% -0? 7%〇3. 根據權利要求2所述的一種油乳劑制備方法，其特征在于：所述的Span-80、甘 露醇單油酸酯、吐溫80、聚氧乙烯40氫化蓖麻油和蔗糖酯占疫苗總體積比例分別為 0? 8% -3. 42%、0. 8% -3. 42%、0. 45% -I. 85%、0. 45% -1. 85%和 0? 2% -0? 5%。4. 根據權利要求1所述的一種油乳劑制備方法，其特征在于：抗原為大腸桿菌、鴨疫里 默氏桿菌、壞死梭桿菌、巴氏桿菌或新城疫病毒，但不限于以上病原。
【專利摘要】本發明公開了一種油乳劑制備方法，屬于獸用生物制品技術領域。本發明包括以下步驟：油相的制備：將Span-80、甘露醇單油酸酯按照一定體積比例加入到經高壓滅菌的藥用白油中混合,經37℃水浴充分搖勻；水相的制備：將吐溫80、聚氧乙烯40氫化蓖麻油和蔗糖酯按照一定的體積比例溶于抗原溶液；乳化：按油相∶水相＝1.5-2∶1的體積比，先將油相放于膠體磨內，開動電機慢速轉動攪拌，同時緩慢加入水相加完后再以8000r/min攪拌10-15分鐘，在終止攪拌前加入濃度為1％的硫柳汞溶液，加入后其最終濃度為萬分之一；半成品檢驗；分裝：定量分裝，并粘貼標簽，置2～8℃保存。本發明制備的油乳劑黏度小，從而取得更好的乳化穩定效果，同時降低免疫注射副反應。
【IPC分類】A61K9/107, A61K47/44, A61K39/17, A61K47/34, A61K39/108, A61K47/26
【公開號】CN105168133
【申請號】
【發明人】林毅, 謝晶, 廖黨金, 李興玉, 于吉鋒, 曹冶, 李江凌, 趙素君
【申請人】四川省畜牧科學研究院
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月8日