7/ mL。最后將上述已經配置好的菌懸液用RPMI1640培養液稀釋1000倍。使其濃度介于 2X103-1X104CFU/mL之間。常見的酵母菌病原體如隱球菌、念珠菌采用CLSI-M27A3法，常 見的絲狀真菌病原體如曲霉、毛霉則采用CLSI-M38A2法（具體操作見參考文獻）。靜置培 養4-7d后觀察判讀結果，最低抑菌濃度（MIC)的判定標準：結果判定在顯微鏡下進行，與陽 性對照孔對比完全抑制，無生長的最低濃度。所有菌株均進行2次重復試驗，每次試驗均包 含標準菌株的測定以保證試驗準確。
[0041] 實驗結果：
[0042] 結果如表1所示，結果顯示在多種常見的侵襲性真菌病原體之中，不同直徑銀包 鈀納米制劑均對隱球菌具有良好的抑制活性，其MIC值約為0. 25-lmg/L，其抗菌活性略次 于兩性霉素B(AmB，MIC= 0? 125-0. 5mg/L)，但顯著高于氟康唑（FCZ，MIC= 16mg/L)。
[0043] 表1 :Pd@Ag納米制劑對常見侵襲性致病酵母和絲狀病原真菌的抗真菌活性檢測 結果
[0044]
[0045]
[0046] 注：FCZ為氟康唑；AmB為兩性霉素B。
[0047] 實施例2.不同濃度的銀包鈀PdOAg納米制劑對HeLa細胞的毒性實驗
[0048] 實驗材料：
[0049] 銀包鈀PdOAg納米制劑（5，ll，30,80，120nm)同實施例1。人宮頸癌細胞（HeLa)， 購自中科院細胞所。
[0050] 需要的試劑：
[0051] DMEM培養基購自美國LifeTechnologies公司
[0052] CCK-8試劑盒購自上海東仁化學科技有限公司
[0053] 儀器設備：
[0054] Synergy2多功能檢測儀（德國BioTek產品）
[0055] 二氧化碳細胞培養箱（日本Sanyo電器公司）
[0056] SW-CT-IF型超凈化工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）
[0057] 實驗方法：
[0058] 實驗前將HeLa細胞（lX104cells/ml)接種于96孔板中，DMEM培養基，37°C，5% C02細胞培養箱中預培養24小時。細胞鋪滿孔底后，將細胞于不同濃度（0、1、2、5、10、20mg/ L)不同直徑的銀包鈀Pd@Ag納米制劑中再次孵育24小時（37°C，5%C02)。作用24小時后， 向每孔加入l〇ulCCK-8溶液，將培養板在培養箱內孵育2小時，隨后用酶標儀測定在450nm 處的吸光度。在不含細胞的培養基中加入CCK-8檢測作為空白對照。處理組通過和不加藥 物的對照組對比獲得細胞活性。
[0059] 實驗結果：
[0060] 結果如圖1所示，總體上隨著藥物濃度的增加，銀包鈀納米制劑對HeLa細胞的毒 性逐步增強。在同等濃度時，5nm直徑的Pd@Ag納米制劑相對而言毒性最強，而其余四種 (11，30,80，120_)?(1_8納米制劑對他1^細胞的抑制作用無顯著差異（？>0.05)。在較 高藥物濃度時，不同直徑納米制劑對HeLa細胞具有明顯的抑制效應，如與10yg/mL納米制 劑共孵育時HeLa細胞的生存率約為原始的60% -69%。
[0061] 當銀包鈀納米制劑濃度低于5yg/mL，則對HeLa細胞無明顯抑制作用，5yg/mL時 他1^細胞生存率約為90%-98%，而1-2 118/1^時他1^細胞生存率正常。因此，低濃度 (彡5yg/mL)Pd@Ag納米制劑（ll-120nm)對HeLa細胞毒副作用較小，而最低抑菌濃度時基 本無毒副作用。
[0062] 實施例3.PdOAg納米制劑（80nm)對不同基因型新生/格特隱球菌的臨床株或分 離株的抑菌實驗
[0063] 實驗材料：
[0064] 銀包鈀PdOAg納米制劑（80nm)同實施例1。
[0065] 研究所用不同基因型的所有隱球菌臨床或環境分離株均由上海市醫學真菌分子 生物學重點實驗室提供，其菌種保藏號依次為SCZ9001-SCZ9045。
[0066] 實驗方法：
[0067] 結合實施例1與例2的結果，我們發現llnm、30nm、80nm直徑的Pd@Ag納米制劑均 具有較好的抑隱球菌效應（MIC= 0. 5yg/mL)、低濃度時對HeLa細胞無明顯毒副作用，而較 之llnm和30nm納米制劑，80nm納米制劑對其它病原真菌抑菌作用更強，因此本發明進一步 評估了PdOAg納米制劑（80nm)對不同基因型、不同來源隱球菌的干預效應。
[0068] 本實驗采用美國臨床實驗室標準化協會CLSI-M27A3法檢測PdOAg納米制劑 (80nm)對不同隱球菌的抑菌效應，其具體方法步驟詳見實施例1。
[0069] 實驗結果：
[0070] 結果如表2所示，結果顯示Pd@Ag納米制劑（80nm)對不同基因型新生/格特隱球 菌的臨床株或分離株均有良好的抑菌效應。對于新生隱球菌而言，不同基因型的臨床或環 境分離株，Pd@Ag納米制劑（80nm)的最小抑菌濃度約為0. 25-2yg/mL(平均MIC90 = 2yg/ mL);銀包鈀對格特隱球菌的抑菌效應相近，MIC為0. 25-2yg/mL(平均MIC90 = 1yg/mL)。
[0071] 上述研究結果提示，Pd@Ag納米制劑（80nm)對各種基因型及不同來源的隱球菌病 原菌均具有良好的抑制效應，其抑菌作用略次于兩性霉素B，具備成為抗隱球菌感染治療藥 物的潛質。
[0072] 表2Pd@Ag納米制劑（80nm)對不同基因型及不同來源隱球菌的抗真菌活性檢測 結果。
[0073]
[0075] 備注：*為隱球菌的基因型或來源，Cn為新生隱球菌，其基因型（VNI，II，III，IV)， Cg為格特隱球菌，其基因型（VGI，II，III，IV);來源包括臨床患者分離（clinical)、動物標 本分離（animal)及環境標本分離（environmental) 〇
[0076] 實施例4.PdOAg納米制劑（80nm)與兩性霉素AmB具有協同抗隱球菌效應實驗
[0077] 實驗材料：
[0078] 銀包鈀PdOAg納米制劑（80)、兩性霉素B同實施例1。不同基因型的新生/格特 隱球菌均由上海市醫學真菌分子生物學重點實驗室提供。
[0079] 實驗方法：
[0080] 菌液制備、結果判讀等方法同實施例1。
[0081] 藥敏板制備方法如下：
[0082] 各菌株分別取無菌96孔板一塊，于每排1號孔加RPMI1640液體培養基100y1 作空白對照；3~12號孔各加上述新鮮配制的菌液99y1 ;2號孔分別加菌液196y1和銀 包鈀PdOAg納米制劑（80nm) 2y1 ;12號孔不含藥物，只加菌液100y1作陽性生長對照。調 配不同濃度的AmB0. 128、0. 064、0. 032、0. 016、0. 008、0. 004yg/mL,在每排的 2 號孔加相 應濃度的AmB2y1，3~11號孔各加1y1。
[0083] 對2~11號孔進行10級倍比稀釋，使各孔的最終銀包鈀PdOAg納米制劑（80)濃 度分別 2、1、0.5、0.25、0? 12、0.06、0.03、0.015、0.008、0.004yg/ml。而AmB的濃度保持恒 定，各孔中DMS0含量均低于1%。將各藥敏板于30°C恒溫箱培養。
[0084] 實驗結果：
[0085] 結果如表3所示，結果顯示Pd@Ag納米制劑（80nm)與AmB具有協同抗隱球菌效 應。在對常見隱球菌標準株的藥敏試驗中，單獨作用時，Pd@Ag納米制劑（80nm)的MIC值 為0. 25-2yg/ml，AmB的MIC值為0. 125-1yg/ml，而聯合作用后PdOAg納米制劑（80nm) 和AmB的MIC值分別降為0. 06和0. 004yg/ml，聯用指數FICI均小于0. 5,可見二者合用 對隱球菌有顯著的協同抗菌作用。
[0086] 表3Pd@Ag納米制劑（80nm)與AmB的聯合抗真菌活性檢測。
[0087]
[0088] 以上已對本發明創造的較佳實施例進行了具體說明，但本發明創造并不限于所述 實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發明創造精神的前提下還可作出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。
【主權項】
1. 銀包鈀納米制劑在制備抗隱球菌感染藥物中的應用。2. 根據權利要求1所述的銀包鈀納米制劑在制備抗隱球菌感染藥物中的應用，其特征 在于，所述的銀包鈀納米制劑的粒徑為l-120nm。3. 根據權利要求1所述的銀包鈀納米制劑在制備抗隱球菌感染藥物中的應用，其特征 在于，所述的銀包鈀納米制劑的粒徑為80nm。4. 根據權利要求1至3任一所述的銀包鈀納米制劑在制備抗隱球菌感染藥物中的應 用，其特征在于，所述的銀包鈀納米制劑的濃度< 5yg/ml。5. 根據權利要求1至3任一所述的銀包鈀納米制劑在制備抗隱球菌感染藥物中的應 用，其特征在于，所述的隱球菌為不同基因型新生隱球菌、格特隱球菌的臨床株或分離株。6. 根據權利要求1至3任一所述的銀包鈀納米制劑在制備抗隱球菌感染藥物中的應 用，其特征在于，所述的抗隱球菌感染藥物，是以銀包鈀納米制劑作為唯一活性成份，或者 包含銀包鈀納米制劑的藥物組合物。7. 根據權利要求1至3任一所述的銀包鈀納米制劑在制備抗隱球菌感染藥物中的應 用，其特征在于，所述的抗隱球菌感染藥物為銀包鈀納米制劑與兩性霉素B聯用。8. -種抗隱球菌聯合用藥物，其特征在于，所述的聯合用藥物的活性成分為銀包鈀納 米制劑與兩性霉素B。
【專利摘要】本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及銀包鈀納米制劑(Pd@Ag)在制備抗隱球菌感染藥物中的應用。本發明經細胞實驗表明，在多種常見的侵襲性真菌病原體之中，不同直徑銀包鈀納米制劑僅對隱球菌具有良好的抑制活性，其抗真菌活性顯著高于氟康唑(FCZ)。本發明還進一步提供了銀包鈀納米制劑與兩性霉素B聯合在制備抗隱球菌感染藥物中的應用。本發明經實驗證明Pd@Ag納米制劑與AmB具有協同抗隱球菌效應。本發明為銀包鈀納米制劑開辟了新的用途，將其用于抗真菌藥物或抗真菌藥物的增效劑，不僅能提高藥物的抗真菌作用，而且在臨床治病真菌耐藥性日趨普遍，耐藥程度日趨嚴重的情況，使抗真菌藥物恢復對耐藥真菌的作用，具有良好的臨床應用前景。
【IPC分類】A61K33/24, A61P31/10, A61K9/14, A61K33/38, A61K31/7048
【公開號】CN105168139
【申請號】
【發明人】方偉, 張超, 法振宗, 廖萬清
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月15日