-(PEG-HA)/DOX復合物處理的化La細胞表現出更強的巧光（p<0. 001)，說明細胞對 陽I-FI-(PEG-HA)/DOX吞隧具有特異祀向性。高濃度HA可阻斷細胞對陽I-FI-(PEG-HA)/ DOX的識別吞隧，說明PEI-FI-(PEG-HA)/DOX增加腫瘤細胞對DOX的吞隧效果是通過載 體上鏈接的HA和腫瘤細胞表面高表達的CD44受體相結合而實現的。因此，本發明的 PEI-FI- (PEG-HA) /DOX可W通過受體-配體結合增加腫瘤細胞對DOX的吞隧，從而增強DOX 對腫瘤細胞的特異性抑制效果，并且有效的降低正常細胞對DOX的攝取，降低了藥物的毒 副作用。 W62] 實施例6
[0063] 將大小合適的處理過的圓形蓋玻片W每孔1片的密度放入12孔板中，每孔 加入LOmL培養液浸泡過夜。棄掉浸泡培養液后，收集對數生長期化La細胞，按照 4.OXIO4Cells/孔接種在圓形載玻片上，置于5%C〇2, 37°C條件下培養24小時。棄掉培養 液后，每孔更換900yL培養液，并添加100yL含PEI-FI- (PEG-HA) /DOX的NS溶液或NS(對 照組），在實驗對比組中加入5iiLHA([HA] = 500iiM)溶液。繼續置于5%C02,37°C條件下 培養4小時。棄掉培養液，用無菌PBS洗1-2遍，每孔加2. 5%戊二醒的PBS溶液800L，靜置 于4°C條件下固定30分鐘。棄掉戊二醒溶液，用無菌PBS洗1-2遍，加化echst33342 (lug/ ml)，覆蓋細胞即可，靜置于37°C染色15分鐘。將化echst33342液吸出，用無菌PBS洗3 遍，在載玻片上滴加一滴巧光封閉劑，將蓋玻片從12孔板中勾出，將有細胞的一面壓到載 玻片上，用激光掃描共焦顯微鏡觀察細胞形態及細胞內巧光分布。參見附圖8值OX終濃度 為12. 5yg/mL)，經陽I-FI-(PEG-HA)/DOX處理過的細胞內巧光強度較高，在細胞內表現出 一定的趨核分布特性，而經高濃度的HA阻斷處理的細胞對PEI-FI- (PEG-HA) /DOX的識別吞 隧大大減弱，說明發明制備的材料能祀向識別腫瘤細胞，測試結果與流式細胞儀檢測結果 一致。 W64] 實施例7 陽0化]在超凈工作臺配制DOX濃度為200. 0yg/mL的純DOX和陽I-FI- (PEG-HA) /DOX的 無菌NS溶液，及500yM的高濃度HA溶液，紫外照射過夜殺菌。收集對數生長期化La細 胞，按lOOOOcells/孔接種在96孔細胞培養板上，置于5%C〇2, 37°C條件下培養24小時。 棄掉培養液后，每孔更換180yL培養液，并加20yL含陽I-FI- (PEG-HA) /DOX或純DOX的 NS溶液或純NS(對照組），在實驗對比組中加入5yLHA溶液（[HA] = 500yM)，每組設5 個平行樣。繼續置于5%C02,37°C條件下培養4小時。棄掉培養液，更換新的不含材料的 培養液，將細胞培養板繼續放置在5%C〇2, 37°C條件下分別培養24小時和48小時。然后 20yL/孔加入MT溶液巧mg/mL)，避光條件下37°C恒溫靜止培養4小時。然后棄去培養 液，并加入200yLDMS0,振蕩15分鐘后用酶標儀測量在570nm處紫外吸收值，并根據此值 計算細胞的存活率。參見附圖9,在兩個時間點，經高濃度的HA阻斷處理過的細胞明顯比 陽I-FI- (PEG-HA) /DOX處理過的細胞存活率高，說明本發明制備的陽I-FI- (PEG-HA)/DOX 具有明顯的祀向治療作用，說明PEI-FI-(PEG-HA)/DOX對癌細胞具有明顯祀向毒性。
【主權項】
1. 一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制備方法，包括： (1) 在聚乙二醇NH2-PEg-COOH的溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺 鹽酸鹽EDC溶液，攪拌，然后加入N-羥基丁二酰亞胺NHS的溶液，攪拌，得到混合溶液；將 混合溶液滴加到聚乙烯亞胺PEI溶液中，攪拌反應3天，透析，冷凍干燥，得到末端為氨基的 PEG修飾的聚乙烯亞胺PEI-PEG;其中，PEI與NH2-PEg-COOH的摩爾比為1:20 ; (2) 在透明質酸HA溶液中加入EDC溶液，攪拌，加入NHS溶液，攪拌，得到混合液；將混 合液滴加到步驟（1)中PEI-PEG的溶液中，攪拌3~4天，透析，冷凍干燥，得到HA修飾的 聚乙烯亞胺PEI-(PEG-HA);其中，PEI-PEG與HA的摩爾比為1:30 ; (3) 將異硫氰酸熒光素FI溶液逐滴加入到步驟（2)中PEI- (PEG-HA)的水溶液 中，在避光條件下，攪拌反應20-30小時，透析，冷凍干燥，得到PEI-FI-(PEG-HA);其中 PEI-(PEG-HA)與FI的摩爾比為 1:10。2. 根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制 備方法，其特征在于，所述步驟（1)中NH2-PEg-COOH的溶液、EDC溶液和NHS溶液的溶劑均 為二甲基亞砜。3. 根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制 備方法，其特征在于，所述步驟（1)中NH2-PEg-COOH溶液的濃度為10-15mg/mL，EDC溶液的 濃度為10_15mg/mL，NHS溶液的濃度為10-15mg/mL，PEI溶液的濃度為2-4mg/mL。4. 根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制 備方法，其特征在于，所述步驟（1)中加入EDC后，攪拌的時間為15~30分鐘；加入NHS后 攪拌的時間為3~4小時。5. 根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制 備方法，其特征在于，所述步驟（1)中EDC與NH2-PEg-COOH的摩爾比為10:1 ;EDC與NHS的 摩爾比為1:1。6. 根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制 備方法，其特征在于，所述步驟（1)中的透析為采用的膜為纖維素透析膜，截留分子量MffCO 為8000-14000,在磷酸鹽緩沖溶液PBS中透析2天。7. 根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制 備方法，其特征在于，所述步驟（2)中PEI-PEG溶液的濃度為2-4mg/mL，HA溶液的濃度為 3-8mg/mL〇8. 根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制 備方法，其特征在于，所述步驟（2)中加入EDC后攪拌的時間為20~30分鐘；加入NHS后 攪拌的時間為3~4小時。9. 根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制 備方法，其特征在于，所述步驟（2)中EDC與HA的摩爾比為1:3 ;EDC與NHS的摩爾比為1:1。10. 根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制 備方法，其特征在于，所述步驟（2)和步驟（3)中溶液采用的溶劑均為超純水。11. 根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制 備方法，其特征在于，所述步驟（2)和步驟（3)中透析采用的膜為纖維素透析膜，截留分子 量MffCO為8000-14000,在去離子水中透析2天。12. 根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制 備方法，其特征在于，所述步驟（3)中得到的PEI-FI-(PEG-HA)負載阿霉素DOX作為納米藥 物緩釋體系用于癌細胞的靶向治療。13. 根據權利要求12所述的一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體 的制備方法，其特征在于，所述PEI-FI-(PEG-HA)負載阿霉素DOX的方法包括：將鹽酸 阿霉素（DOX)溶于甲醇溶液中，加入三乙胺，逐滴加入PEI-FI-(PEG-HA)水溶液，攪拌 12-24小時，離心，冷凍干燥得到負載阿霉素的透明質酸修飾的聚乙烯亞胺藥物緩釋體系 PEI-FI-(PEG-HA)/DOX;其中PEI-FI-(PEG-HA)與DOX的摩爾比為1:20,攪拌反應時為開放 體系。14. 根據權利要求13所述的一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的 制備方法，其特征在于，所述三乙胺與PEI的摩爾比是5:1。
【專利摘要】本發明涉及一種透明質酸靶向的多功能支化聚乙烯亞胺藥物載體的制備方法，方法包括：EDC和NHS活化的NH2-PEG-COOH滴加到PEI溶液中，攪拌反應，透析后冷凍干燥，得PEI-PEG；EDC和NHS活化的HA滴加到PEI-PEG溶液中，攪拌后透析，冷凍干燥后得PEI-(PEG-HA)；將FI溶液滴加到PEI-(PEG-HA)水溶液中，避光攪拌，透析，冷凍干燥，即得。本發明成本低，方法簡單，條件溫和，易于操作，具有良好的應用前景。本發明的PEI-FI-(PEG-HA)負載DOX作為納米藥物緩釋體系具有良好的藥物緩釋效果，對CD44受體表達的腫瘤細胞具有顯著的靶向性和明顯的抑制效果。
【IPC分類】A61K47/34, A61K31/704, C08G81/00, A61K47/36, C08B37/08, A61P35/00
【公開號】CN105169400
【申請號】
【發明人】史向陽, 陳晨, 周本青
【申請人】東華大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年8月10日