A) /DOX的紫外吸收光譜圖； W40]圖5為實施例3中體外不同抑條件下DOX從PEI-FI-(PEG-HA)/DOX中釋放的累 積釋放曲線；
[0041]圖6為實施例4中經生理鹽水（N巧、PEI-FI-(PEG-HA)、D0X和陽I-FI-(PEG-HA)/ DOX處理24小時后的化La細胞活力柱狀分析圖；
[0042] 圖7為實施例5中經NS和陽I-FI- (PEG-HA) /DOX處理4小時后的化La細胞流式 分析圖（縱坐標為細胞內吞DOX后的巧光強度，與吞隧量成正比；***，p<0. 001)。對照組 為化La細胞先經過高濃度自由HA阻斷處理，再進一步通過陽I-FI- (PEG-HA) /DOX復合物 處理4小時；圖8為實施例6中經NS、PEI-FI- (PEG-HA) /DOX處理4小時后的化La細胞激 光共聚焦顯微鏡成像圖，其中材料DOX濃度為12. 5yg/mL。對照組為化La細胞先經過高濃 度自由HA阻斷處理，再進一步通過陽I-FI- (PEG-HA) /DOX復合物處理4小時； 陽0創圖9為實施例7中經NS、D0X和陽I-FI- (PEG-HA) /DOX處理4小時后，分別用新培 養液培養24小時和48小時的細胞活力柱狀分析圖（**，於0. 005 ;***，於0.OOl;)。對照組 為化La細胞先經過高濃度自由HA阻斷處理，再進一步通過陽I-FI- (PEG-HA) /DOX復合物 處理。
【具體實施方式】
[0044] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，運些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可W對本發明作各種改動或修改，運些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。 陽045]實施例1
[0046] (1)在 5mLNHz-PEG-COOH的DMSO溶液（12mg/mL)中，加入 5mLEDC的DMSO溶液 (7.6mg/血），攬拌反應0. 5小時，然后加入5血N服的DMSO溶液（4.6mg/血），繼續攬拌反應 3小時。然后逐滴滴加到IOmL陽I的DMSO的溶液巧mg/血）中，快速攬拌反應3天。反應 產物先用PBS緩沖液透析1天（3X化)，然后用去離子水透析2天化X化)，冷凍干燥得到 白色固體粉末陽I-PEG。 W47] 似在10血HA的水溶液化57mg/血）中，加入5血邸C的水溶液（3.Omg/血），攬 拌反應0. 5小時，然后加入3mLN服的水溶液化75mg/mL)，攬拌反應3小時。然后逐滴滴加 到上述IOmL陽I-PEG的水的溶液化5mg/mL)，快速攬拌反應3天。反應產物用去離子水透 析3天化X化)，冷凍干燥得到白色固體粉末PEI- (PEG-HA)。
[0048] (3)將2血FI的水溶液化48mg/mL)逐滴加入10血陽I-(PEG-HA)水溶液巧mg/ mL)中，避光條件下，攬拌反應24小時，反應產物用去離子水透析2天化X化)，冷凍干燥得 到橘黃色固體粉末陽I-FI-(PEG-HA)。
[0049] 參見附圖2(a)古NMR譜，2.2-3. 5ppm是陽I的亞甲基質子信號，3.5-3.6ppm是 陽G的結構單元的亞甲基質子信號，根據它們積分面積之比，計算出每個陽I分子表面修飾 上15個陽G(其投料摩爾比為陽I:NHz-PEG-COOH= 1:20)，由于NHz-PEG-COOH可能發生 自連接，陽G可能會成鏈狀連接到陽I上；參見附圖2(b)古NMR譜，在2.2-3. 5ppm是陽I 的亞甲基質子信號，3. 5-3.6ppm是PEG的結構單元的亞甲基質子信號，1. 8-2. 2ppm是HA的 亞甲基質子信號，根據它們積分面積之比，計算出每個陽I分子表面修飾上15個陽G，28個 HA(其投料摩爾比為陽I:NH2-PEG-C00H:HA= 1:20:30)，陽I表面和陽G末端均有氨基存 在，HA既能和陽I直接連接，也能通過陽G與陽I相連，但主要連接方式是通過陽G與PEI 相連成陽I-(PEG-HA);
[0050] FI的紫外吸收峰位于500皿左右，參見附圖3,該峰的出現說明成功制備FI標記 的多功能化陽I，即為陽I-FI-(PEG-HA)。
[0051] 修飾前后的表面電勢結果如表1所示。PEI-PEG帶有正電荷，經HA修飾后，表面電 勢從23. 5mV變為-35. 4mV。在表面進一步修飾FI后，表面電勢升高到-17. 2mV。修飾前后 的電勢變化說明陽G、HA和FI已經修飾到陽I表面。
[0052] 表 1 陽I-PEG、PEI-(陽G-HA)、陽I-FI-(陽G-HA)的表面電勢
[0053]
[0054] 實施例2
[0055] 在1. 7mg/mL的DOX的甲醇溶液中加入10yLS乙胺，將其逐滴加入10血 PEI-FI-(PEG-HA)的水溶液（3.Omg/mL)中，常溫開口攬拌反應24小時。反應結束后，將 溶液轉移到15mL離屯、管中，在轉速為8000巧m條件下離屯、5分鐘，將上清液凍干即可得到 反應產物陽I-FI-(PEG-HA)/D0X。參見附圖4,上清液用紫外分析，DOX的紫外吸收峰位于 480nm，根據所制備的納米藥物緩釋體系在480nm的紫外吸光值與DOX標準曲線作比較，可 W得出DOX的含量，從而可W計算出DOX的上載率為88%。DOX對陽I-FI-(PEG-HA)的摩 爾當量是17. 5:1。
[0056] 實施例3
[0057] 將實施例2制備的陽I-FI- (PEG-HA) /DOX分別用抑=7. 0和抑=5. 4的緩沖液 溶解成濃度為Img/mL的溶液，取ImL放入透析袋中固定，置于含有9mL不同抑的緩沖液的 容器中，放在37°C搖床中振蕩。在0. 5，1，2,3,5,8，12，16,24,36,48小時時間點取樣。每 次取透析袋外液體ImU測量其480nm處吸光度值，再向透析袋外加入對應的緩沖溶液ImL。 用此方法得到體外不同抑條件下DOX從陽I-FI-(PEG-HA)/DOX中釋放的釋放曲線。參見 附圖5,陽I-FI-(PEG-HA)/DOX中DOX在酸性條件下要比正常條件下釋放的快，在釋放8小 時后DOX的釋放量達到穩定。DOX在抑=5. 0的弱酸性環境中從陽I-FI-(PEG-HA)/DOX中 釋放速度比在抑=7. 4的中性環境中要快。說明運種載藥體系具有一定的抑響應性，在 腫瘤組織類似的弱酸性環境中的釋放速度比正常組織釋放速度快，一定程度減少DOX對正 常組織的毒性，提高對腫瘤細胞惡性增殖的抑制效果。 陽0郎]實施例4
[0059]配制DOX濃度分別為 40. 0、80. 0、100. 0、150. 0、200.Oyg/mL的純D0X、 陽I-FI- (PEG-HA)和陽I-FI- (PEG-HA) /DOX的無菌生理鹽水（N巧溶液（材料加入培 養液中，其濃度要稀釋10倍），紫外照射過夜殺菌。收集對數生長期化La細胞，按照 1. 0XIO4Cells/孔接種在96孔細胞培養板上，置于5 %C〇2, 37°C條件下培養24小時。棄掉 培養液后，每孔更換180yL培養液，并加20yL含不同DOX濃度的陽I-FI-(PEG-HA) /D0X、 純DOX或陽I-FI- (PEG-HA)的NS溶液或純NS(對照組），每組設5個平行樣。將細胞培養 板繼續放置在5%C02,37°C條件下培養24小時。然后按20iiL/孔加入MT溶液巧mg/mL)， 避光條件下37°C恒溫靜止培養4小時，然后棄去培養液，加入200yLDMS0,振蕩15分鐘后 用酶標儀測量在490nm處紫外吸收值，并根據此值計算細胞的存活率。參見附圖6,與空白 對照組相比，經材料陽I-FI- (PEG-HA)處理的實驗組細胞活性達到80 %W上，細胞存活率 變化不大，說明載體材料PEI-FI- (PEG-HA)對化La細胞沒有表現出明顯的細胞毒性；同等DOX濃度條件下，經陽I-FI-(PEG-HA) /DOX處理的實驗組比經純藥DOX處理的實驗組化La 細胞存活率高，說明PEI-FI-(PEG-HA)/DOX具有一定的藥物緩釋效果。 W60] 實施例5
[0061]配制DOX濃度分別為 80. 0、100. 0、150.Oyg/mL的陽I-FI-(PEG-HA)/D0X無菌NS溶液，及500yM的高濃度HA溶液。紫外照射過夜殺菌，收集對數期化La細胞，按照 2.OXIO5Cells/孔接種在12孔細胞培養板上，置于5%C02,37°C條件下培養24小時。棄 掉培養液后，每孔更換900yL培養液，并添加100yL含不同DOX濃度的PEI-FI- (PEG-HA) / DOX或純DOX的NS溶液或NS(對照組），在實驗對比組中加入5yLHA溶液（[HA]= 500iiM)。繼續置于5%C02,37°C條件下培養4小時。倒去培養液，用PBS洗涂3次，加 入100yL膜酶消化約3分鐘后，立即加入1血左右PBS吹打并收集細胞，轉移到10血離 屯、管中100化pm離屯、5分鐘，繼續用ImLPBS重懸。W巧光分辨率作為參數，將濾網過濾 重懸的細胞液作為樣品加入到流式細胞儀中進行檢測，得到細胞對藥物的吞隧結果。參 見附圖7，經陽I-FI-(PEG-HA)/DOX處理化La細胞比經高濃度自由HA溶液預處理再添加 PEI-FI