祀向組的腫瘤組織顯出較高的巧光強度，提示SCFv-IP/切5. 5-siRNAs NPs主要被腫瘤組織攝取，非祀向組腫瘤組織的巧光強度明顯低于祀向組，提示被腫瘤組織 所攝取的切5. 5-siRNAs量少于祀向組。
[0175] 實施例2
[0176]本實施例的祀向載體包括CD44v6單鏈抗體、W及納米載體IONP-PEI，其共載了吉 西他濱和siBmi-1。本實施例的內容包括實驗方法和結論分析兩部分。
[0177] 一、實驗方法
[017引 1、細胞培養
[0179] 人膜腺癌細胞株Panc-I在含10%胎牛血清的高糖DMBl培養基，恒溫37°C，5%C〇2 培養箱中培養。
[0180] 2、Gem-IONP(搭載吉西他濱的載體IONP) W及svFv-Gem-IONP(搭載吉西他濱和 SiBmi-I的祀向載體）的制備及表征
[0181] (1)在冰浴中，將S乙胺（Trieth^amine)和酸敏四膚巧-fluorenylmethoxy carbonyl(Fmoc)-Gly-Phe-Leu-Gly(GFLG)-nitrophenylesterpeptide)按照 7.Sumol: 6. 8ymol加入到I.Omol的乙臘溶液中。
[0182] (2)將吉西他濱和S乙胺（Triethylamine)按照 13. 6umol:13. 6umol溶于Iml去 離子水中。
[0183] (3)將上述（2)的溶液加入到（1)中，旋轉混勻5min后，將混合液置于冰鹽浴中反 應lOOmin。
[0184] (4)梯度壓力法去除混合液中的乙臘和水，加水定容至1ml。用6M鹽酸滴定至PH 2.0,將得到的混合物4°C保存。
[0185] (5)用IM鹽酸反復洗涂得到的溶液，并用梯度壓力法去除最后的溶液。最后得到 的固體在真空干燥器中徹底抽干得到固體粉末（Fmoc)-GFLG-Gem。
[0186] (6)用0. 4ml的二甲基亞酷胺（N,N-dimeth}dmethanamide)將得到的固體溶解，向 溶液中加入IOOul贓晚（piperidine)，室溫震蕩5min混勻，將反應液置于冰鹽浴，立即加入 乙酸。用二氯甲燒（dichloromethane)萃取反應液后，真空干燥器凍干的到GFLG-Gem復合 物。
[0187] (7)向Img的IONPs溶液中加入108. 6yg的二亞胺巧DAC)和196. 9yg的N-徑 基硫代班巧酷亞胺（SUl化-NHS)，室溫反應15min。將得到的酷胺化的IONPs和420. 4ug GFLG-Gem復合物4°C酷胺化反應得到Gem-IONP復合物。
[0188] 做將1. 33mg陽I加入到IONP-Gem溶液中室溫反應30min得到Gem-IONP-PEI。
[0189] (9)將47.lug馬來酷亞胺-聚乙二醇-班巧酷亞胺班巧酸醋（mal-PEG-N服） 加入到上述溶液中室溫反應30min。將750ugscFvtD44ve加入到上述溶液，4°C過夜得到 scFv-Gem-IONP(即scFv-Gem-IONP-PEI，可W復合SiBmi-I)。最后得到的（GFLG) -Gem-IONP 和SCFv-(GFLG)-Gem-IONP復合物用磁力分離器純化，過濾器過濾除菌。
[0190] (10)將Gem-IONP及svFv-Gem-IONP用透射電鏡觀察其表面特征及粒徑大小。
[0191]3、吉西他濱藥物釋放試驗
[0192] (1)將IOulscFv-Gem-IONP溶于 90ulPBS緩沖液中（cathepsinB的終濃度是 IuM)，每個時間點制備兩管，將PH值分別調至5. 5和7. 4。
[019引似37°C溫箱解育，在0，6，12，24，36，48，72，96小時，每個PH值分別取出一管，超 濾管過濾去除I0NP，收集過濾液，高效液相分析法（乙臘：水（20:80,v/v)，含有0.Ol% = 氣乙酸，流速0. 3血/min,波長270nm)，上機檢測溶液中吉西他濱濃度。
[0194] (3)計算每個時間點釋放的吉西他濱藥物量，作圖。
[0195] 4、細胞毒性試驗
[0196] 為評估SiBmi-I聯合吉西他濱免疫納米復合物對Panc-I的細胞毒性，進行MTS實 驗。每組設3個復孔，該實驗獨立重復3次，所得數值表示為均數+標準誤。
[0197] (I)Panc-I細胞接種在96孔板，IXIO^孔，無抗生素完全培養基中貼壁生長24 小時。加入不同處理，實驗分組為：Gem，Gem-IONP,svFv-Gem-IONP，和scFv-Gem-IONP/ SiBmi-I,siRNAs量為每孔IOpmol。Gem濃度為l-20uM，PEI-IONP依據不同濃度Gem而定。 未處理細胞作為空白對照。37°C，5%C〇2培養箱中培養72小時。
[0198] (2)去除培養基，每孔加入100y1含有20ulMTS溶液的無血清培養基，37°C，5% C〇2培養箱中繼續培養4小時。
[0199] (3)W空白組調零，酶標儀檢測490nm吸光度值。
[0200] 細胞存活率（％ )二（A實驗組/A對照組）X100 %。
[0201] 5、細胞調亡試驗
[0202] (I)Panc-I細胞接種在6孔板，2X10^孔，無抗生素完全培養基中貼壁生長24小 時。加入不同處理，①Control②Gem③Gem-IONP④scFv-Gem-IONP⑥scFv-Gem-IONP/ siBmi-1。siRNAs量為每孔lOpmol，Gem濃度為加M，37°C，5%C〇2培養箱中培養72小時。
[0203] 似具體轉染方法如下：
[0204]A、siRNAs濃度為lOOnmol/L。按N/P比值=20 制備IP/FAM-siRNAs復合物，混勻 后室溫靜置20分鐘，然后加入100y1轉染專用培養基化ti-MEM中混勻。
[0205]B、棄去24孔板中舊DMEM培養基，每孔加入400ul新鮮的無血清DMEM培養基。然 后將上述100y1混合物逐滴加入孔板中，輕輕搖勻。37°C，5%C〇2培養箱中培養。
[0206] (3)檢測細胞調亡：門TC-ANNEXINV/PI染色流式細胞儀檢測法
[0207] 原理：在細胞發生調亡的早期，位于細胞膜內側的憐醋酷絲氨酸（P巧會外翻到細 胞膜外側。FITC標記的AnnexinV選擇性與PS結合，呈綠色巧光。壞死細胞或調亡晚期細 胞，細胞膜完整性喪失，AnnexinV-FITC和艦化丙晚（PI)均可使其染色。因此，用Annexin V-FITC和PI染色后，正常的活細胞不被染色；調亡早期的細胞FITC陽性、PI陰性；壞死細 胞和調亡晚期的細胞可W同時被AnnexinV-FITC和PI染色。
[020引染色方法：
[0209] ①棄舊培養基，用PBS輕洗兩次，0. 25 %膜蛋白酶消化收集細胞到離屯、管內， 900巧m離屯、3分鐘，沉淀細胞。小屯、吸除上清，避免吸走細胞。加入約1毫升PBS，重懸細 胞，900rpm離屯、3分鐘，沉淀細胞，小屯、吸除上清。輕輕彈擊離屯、管底W適當分散細胞，避免 細胞成團。
[0210] ②每管加入500y1BindingBuffer,輕輕吹打制備單細胞懸液。
[0211] ③每管加入FITC/ANNEXINV加1，混勻后室溫避光解育15分鐘，然后每管加入 PI染液加1，室溫解育5分鐘后立即上流式細胞儀檢測。
[0212] 6、Westernblot試驗
[021引調亡相關蛋白Bcl-2,Bax的檢測用Westernblot法，具體如下：
[0214] (1)細胞總蛋白提取
[0215] 轉染72小時后提取細胞總蛋白，過程如下：
[0216] A、棄去舊培養基，用PBS輕輕洗細胞一遍。
[0217] B、每孔加入 100y1RIPA和 1y1PMSF(終濃度為ImM)。
[021引 C、細胞刮刮數下，使裂解液與細胞充分接觸，冰上裂解30分鐘。
[0219] D、4°C，12, 000Xg離屯、30 分鐘。
[0220] E、小屯、吸取上清，內含有細胞總蛋白。
[0221] (2)蛋白濃度測定
[0222] BCA-IOO蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度（96孔板法），具體過程如下：
[0223] A、按A:B= 50 :1制備A+B混合液，即每個反應使用200y1SolutionA+4y1 SolutionB，混勻后使用，即配即用。每個樣品要做3個平行孔。
[0224] B、BSA標準品和樣品的準備：樣品用PBS配制，稀釋5倍巧y1蛋白原液 +20ylPBS)，使待測定的濃度位于標準曲線的線性部分。每個反應準備3個平行測定。標 準曲線一般取5-6個點即可，根據樣品的濃度確定各點的具體濃度。BSA也用PBS稀釋。按 下表的次序加入BSA標準品或樣品及SolutionA+B混合液，混勻。
[0227] C、蓋上蓋子混合30秒，37°C解育30分鐘。
[022引 D、冷卻至室溫。
[0229] E、酶標儀上測定490nm的吸光度值（OD值）。
[0230] F、用Excel軟件分析并繪制標準曲線，R2> 0. 99曲線可用。根據未知樣品的吸
[0231] 光度值，用公式：y= 0. 2729X+0. 0793(y=吸光度，X=蛋白濃度，R2= 0. 9994)可 W得出未知樣品的濃度，實際濃度需要乘W樣品的稀釋倍數。
[0232] (3)制膠。依次制備12%分離膠和5%濃縮膠。
[023引 （4)蛋白標本的制備：每孔上樣標本量相同（25yg)，在0.2m化P管中分別加入： 樣品蛋白（25yg)+4ylSXloadingbuffer+RIPA(含 1%PMSF),總體積 20^1。
[0234]妨蛋白變性。蛋白樣品與5X蛋白上樣緩沖液混勻，置于10(TC水浴8分鐘，瞬 時離屯、，冷卻至室溫，直接上樣或-80°C保存備用。
[023引 （6)上樣。每孔20y1，空白孔加15y1RIPA巧y1 5X蛋白上樣緩沖液，在邊緣 孔上預染蛋白marker。
[0236] (7)電泳。濃縮膠60V恒壓電泳，當漠酪藍至分離膠時，改用120V恒壓電泳，至漠 酪藍至分離膠底部，停止電泳。
[0237] (8)轉膜。PVDF膜剪去右上角W標記方向，然后將標記好的PVDF膜置于甲醇中活 化IOmin后放入轉移緩沖液中備用。從玻璃板中取下凝膠，按照一定的順序將海綿、濾紙、 凝膠、PVDF膜置放于電轉夾上，放入電轉槽中，150mA恒流電轉60min。
[023引 （9)封閉。轉膜后，取出PVDF膜