續培養7天。每24小時隨機取出一塊板，用MTS法測定細胞吸光度。
[0121] 10、細胞周期分析
[0122] (I)Panc-I細胞經IP/SCR或IP/siBmi-1轉染后繼續培養48小時，棄上清，預冷 PBS洗兩次，0. 25 %膜蛋白酶消化收集細胞到離屯、管內，900rpm離屯、3分鐘，沉淀細胞。小屯、 吸除上清，殘留約50微升左右的培養液，W避免吸走細胞。加入約1毫升冰浴預冷的PBS， 重懸細胞，900rpm離屯、3分鐘，沉淀細胞，小屯、吸除上清，殘留約50微升左右的PBS，W避免 吸走細胞。輕輕彈擊離屯、管底W適當分散細胞，避免細胞成團。
[0123] (2)細胞固定：加入1毫升冰浴預冷70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4°C固定過夜。 900rpm離屯、3分鐘，沉淀細胞。小屯、吸除上清，加入約1毫升冰浴預冷的PBS，重懸細胞，共 洗涂兩次。輕輕彈擊離屯、管底W適當分散細胞，避免細胞成團。
[0124] (3)艦化丙晚染色液的配制：根據待檢測樣品的數量配制適量的艦化丙晚染色 液，即配即用：
[0125] 1個樣品 6個樣品 12個樣晶 染色巧沖液 0.5m! 3ml 6ml 賄化丙晚染包液25)ll 150|il 300川 pOX) RNascA(50X)IOyl 60^1 12〇ul Finalvolume ().535ral 3.21ml 6.42ml
[0126] (4)染色：每管細胞樣品中加入0.5毫升艦化丙晚染色液，緩慢并充分重懸細胞沉 淀，37°C避光溫浴30分鐘。隨后立即上流式細胞儀進行檢測。
[0127] (5)流式檢測和分析：用流式細胞儀在激發波長488nm波長處檢測紅色巧光，同時 檢測光散射情況。采用Cellquest和ModFit軟件進行設口、光散射分析和細胞DNA含量分 析。
[012引 11、克隆形成試驗
[0129] (1)Panc-I細胞接種在24孔板，5X10^孔，無抗生素完全培養基中貼壁生長24小 時。
[0130] 似去除舊培養基，分別加入IP/SCR和IP/siBmi-1 (N/P= 20)復合物及新鮮培養 基共500y1進行轉染，各復合物所含SiRNAs量設定為lOOnM。
[0131] (3) 37°C，5%C〇2培養箱中培養6小時后更換為新鮮無抗生素完全培養基，每孔 500ul，繼續培養48小時。
[013引 （4)棄去舊培養基，PBS洗細胞立次，用0. 25%膜蛋白酶消化收集細胞，制備單個 細胞懸液，把細胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM完全培養基中備用。
[0133] (5)平板克隆形成試驗：
[0134] (a)取2000個細胞接種于6孔板中，每孔加完全培養基2ml，并輕輕轉動，使細胞 分散均勻。置37°C，5%C02培養箱中靜置培養14天，出現較多肉眼可見的克隆。重復接種 =孔。
[013引 化）棄去上清液，用PBS小屯、浸洗2次。加入純甲醇2mL，固定15分鐘。然后去固 定液，加適量Wri曲t-Giemsa應用染色液染色10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液， 空氣干燥，直接肉眼觀察。
[0136] (6)軟瓊脂克隆形成試驗：
[0137] (a)將1. 2 %低烙點瓊脂糖與2XDMEM完全培養基（含有2X抗生素和20%FB巧 W1:1的體積比混合制備0. 6%的底層瓊脂，6孔板中每個孔1. 4ml溫室凝固。
[013引 化）將1. 2 %低烙點瓊脂糖與2XDMEM完全培養基（含有2X抗生素和20%FB巧 W1:1的體積比在無菌試管中相混W后，再向管中加入0.2mL的細胞懸液（共5000個細 胞），充分混勻，注入鋪有0.6 %的底層瓊脂培養板中，逐形成雙瓊脂層。室溫靜置約1小 時，待上層瓊脂凝固后，置入37°C5%C02溫箱中培養14天。每S天補充含10%FBS的完 全DMEM培養基Iml。
[0139] (C)低倍顯微鏡下計數含50個細胞W上的克隆，計算細胞集落形成率，SpotII采 集圖像。
[0140] 12、遷移和侵襲試驗
[014d (1)侵襲試驗前，在Transwell小室的上室鋪250Jig/mlMatrigel膠，置于37°C4 小時，待膠凝固后備用。遷移試驗無需鋪膠。遷移和侵襲試驗W下步驟相同。
[0142] (2)Panc-l細胞經IP/SCR或IP/siBmi-1轉染48小時后，從24孔板消化下來，并 用無血清高糖DMEM培養基重懸，按IXIO^孔接種在化answell小室的上室，并加入0. 1% BAS平衡滲透壓。在下室加入SOOiil含10 %胎牛血清的高糖DMEM培養基誘導其遷移、穿 過8ym孔徑的聚碳酸醋膜。
[0143] (3)37°C、5%C〇2飽和濕度條件下培養20小時（遷移試驗）或40小時（侵襲試 驗）。
[0144] (4)取出小室，用棉簽輕輕擦去上室面細胞，室溫充分干燥。
[0145] (5)純甲醇室溫下固定下室面細胞15min。
[0146] 化)PBS洗2次，棉簽擦干上室面，室溫下風干5min。
[0147] (7)Wri曲t-Giemsa應用染色液染色30分鐘，用雙蒸水洗3次，室溫充分風干。
[0148] (8)置于顯微鏡下觀察，每小室各取6個IOOX視野，計數穿膜細胞數，求得單個視 野的平均穿膜細胞數。
[0149] 13、體內膜腺癌祀向性研究
[0150] (1)裸鼠皮下移植瘤形成
[0151] 選取體重為Hg±lg的雌性BALB/C(nu/nu)裸鼠，將lXl〇7處于對數生長期的 Panc-I細胞用300yIPBS制成細胞懸液，皮下注射于裸鼠背部肩腫區，成瘤率> 90%。
[0152] (2)活體巧光成像
[0153]scFv-IP與近紅外染料切5. 5標記的20Ji gsiRNAs按N/P= 20混合，形成 SCFv-IP/切5. 5-siRNAs復合物，用PBS稀釋后經裸鼠尾靜脈注射。注射前行巧光成像掃描。 注射后于12h，24h，4化再次行巧光成像掃描。觀察Panc-I皮下移植瘤的巧光信號改變。
[0154] (3)離體巧光成像
[0155] 注射24h后，祀向組腫瘤部位仍然呈現強巧光，而非祀向組腫瘤區域巧光信號明 顯減弱，至48小時祀向組腫瘤區域仍有較強巧光，而非祀向組巧光強度減弱非常明顯。將 裸鼠過度麻醉處死，剝離腫瘤W及屯、、肝、脾、腎等重要組織器官，再次進行巧光成像。
[0156] 14、統計方法
[0157] 兩組均數間比較采用t檢驗，多組均數間比較采用單因素方差分析。應用SPSS 17. 0化rwindows統計軟件進行統計學處理。顯著性差異水平為P< 0. 05。
[0158] 二、結論分析
[0159] 1、scFv-IP/siRNAs納米微粒的細胞內吞及在細胞內的分布
[0160] scFv-IP/切3-siRNAs轉染Panc-I細胞后如圖1所示，siRNAs分布在細胞質內，且 祀向組轉染后的巧光強度明顯地高于非祀向組。FITC標記的小鼠抗6X化stag單克隆抗體 巧光顯微鏡下顯示綠色巧光，其可W特異性地與scFvCD44v6結合，因此只有內吞SCFv-IP/ SiRNAs的細胞才顯示出綠色巧光。如圖2所示：所有有切3-siRNAs紅色巧光出現的細胞 均有綠色巧光出現，表明scFvCD44v6成功連接到IP上并被細胞內吞，將SiRNAs帶入到細 胞質中。
[0161] 2、轉染率分析
[0162] 成功轉染的細胞在流式細胞儀檢測時為綠色巧光，綠色巧光細胞的比列簡介表 示轉染細胞的轉染率。如圖3所示：IP/FAM-siRNAs組的轉染率為巧9. 87% ±5. 53% ); scFv-IP/FAM-siRNAs組的轉染率為（89. 75% ±2. 21% )。結果表明，在SiRNAs轉染濃度 相同時，祀向組的轉染率高于非祀向組，說明scFvcd44w可W促使更多的SiRNAs轉運至細胞 內。
[016引 3、SiBmi-I沉默Bmi-I基因表達的驗證
[0164]IP/siBmi-1 和scFv-IP/siBmi-1 處理Panc-I細胞后，Bmi-I基因在mRNA和蛋白的 表達量分別降至對照的化0. 00 % ± 7. 07 % )VS(37. 00 % ± 2. 83 % )(P< 0. 05)，（40. 80 % ±4. 92 % )VS(36. 85% ±7.93%) (p< 0.05)。提示SCFv-IP祀向組有更好的基因沉默功 能。
[0165]4、細胞增殖實驗
[0166] 為了驗證祀向組基因沉默后與非祀向組在影響Panc-I細胞的生物學功能方面 對比進行了后續實驗。如圖4所示，處理后，在細胞生長的7天時間里，祀向組的細胞數 一直低于非祀向組，在實驗終點時，兩組的細胞數分別為化98 + 0. 04)X104(祀向組） vs(l. 23 + 0. 06)Xl〇4(非祀向組）（P< 0. 05)。
[0167] 5、細胞周期分析
[0168] 祀向組和非祀向組處理細胞后，處于G0/G1期的細胞數分別為化9. 27 % ±2. 46% )VS巧7. 25% ±1.33% )(P< 0.05)，S期的細胞數分別為（12. 47% ±2.46% ) vs(26. 39% ±1. 34% )(P< 0. 05)。結果表明，祀向組將更多的細胞阻滯在G0/G1期。
[0169] 6、克隆形成試驗
[0170] 如圖5所示，祀向組處理細胞后，形成的細胞集落更少、更小，克隆形成能力更弱。
[0171] 7、遷移和侵襲試驗
[0172] 如圖6所示，當祀向組和非祀向組分別沉默Bmi-I基因后Panc-I細胞遷移和 侵襲均較對照組明顯減少，且祀向組少于非祀向組分別為：（89±8.02)vs(158±7.78)(P < 0.OW和（89. 3 + 8. 0^vs(137±9. 61)(p< 0.OW。
[0173] 8、體內膜腺癌祀向性
[0174] 建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察SCFv-IP在裸鼠體內對膜腺癌的祀向結合。尾靜 脈注射scFv-IP/切5. 5-siRNAs復合物，切5. 5-siRNAs用量為20 y g/動物。NIRF成像可觀 察到切5. 5-siRNAs NPs在腫瘤組織的聚集。如圖7所示：在注射后12小時，祀向組和非祀 向組均表現出較多巧光物質聚集在腫瘤組織，達到最強。在24小時和48小時繼續觀察，祀 向組腫瘤部位和非祀向組腫瘤部位巧光都逐漸減弱。但祀向組腫瘤部位巧光強度始終高于 非祀向組。48小時后將動物安樂死，剝離出腫瘤組織和屯、、肝、脾、腎等重要器官再次進行巧 光呈像，如圖8所示，