，TBST洗5minX3次，置于封閉緩沖液中室溫封 閉化。
[0239] (10)解育一抗。用抗體稀釋液稀釋一抗（TubulinmAb1:1000,Bmi-ImAb1 : 2000)。根據預染蛋白marker大小切PVDF膜，分別解育一抗，4°C搖床過夜。TBST洗膜 5minX3 次。
[0240](11)解育二抗。用抗體稀釋液稀釋二抗（1 :1000)，室溫解育二抗2小時。TBST洗 膜 5minX3 次。
[0241] (12)曝光。把PVDF膜置于曝光盒內，均勻涂上化學發光液，蓋上膠片，暗室內曝光 0.5-5min。把膠片置于顯影液中顯影，定影液中定影。觀察條帶。用ImageJ軟件分析圖 像。
[0242] 7、體內抑制膜腺癌研究
[024引當腫瘤體積達~IOOmm3,荷瘤小鼠隨機分為8組（n= 6)，分別接受不同藥物的單 劑量處理：（i)PBS(control)，（ii)IP/SCR，（iii)IP/siBmi-l，（iv)scFv-IP/siBmi-l，（V) Gem, (vi)Gem-IONP，（vii)scFv-Gem-IONP，（￥；[;[;08。尸￥-66111-10^/318111；[-1(2011邑/動物）。 每=天觀察動物一般情況和腫瘤生長情況。用游標卡尺測量腫瘤大小，計算腫瘤體積= 化XW2)/2,其中L是腫瘤最長徑，W與L垂直。實驗終點設置為21天，至IJ達實驗終點時將 動物安樂死。取出腫瘤組織進行組織病理學分析。剝離的腫瘤馬上W4%多聚甲醒固定，石 蠟包埋、制備6ym切片，分別進行H&E染色、免疫組化染色分析。
[0244] 二、結論分析
[0245] 1、Gem-IONP和scFv-Gem-IONP納米微粒的制備及測定
[0246] 吉西他濱通過化學反應與酸敏四膚形成GFLG-Gem,在加入邸AC和SUlfo-N服 反應條件下，通過酷胺化反應及正負電荷之間吸引作用，將scFv、Gem和IONP偶聯復 合形成scFv-Gem-IONP，并最終形成既可W偶聯吉西他濱，又可W負載SiRNAs的復合物 scFv-Gem-IONP-PEI。如圖9所示，通過透射電鏡進一步驗證聚合物的形成和形貌。形成的 復合物為規則的球形，分布均勻，W3-5個IONP小粒子為中屯、，周圍環繞單鏈抗體、吉西他 濱、PEI和siRNA。運些微粒的直徑分布在60nm左右，粒徑小，利于細胞的內吞。粒子表面 所帶的電荷引起染色劑過度吸附，從而造成粒子顏色較深。
[0247] 2、吉西他濱藥物釋放試驗
[0248] 將IOulscFv-Gem-IONP溶于含有IuM(終濃度）組織蛋白酶B(cath巧SinB)的 90ulPBS緩沖液，IONP和Gem之間的鏈接是通過酸敏四膚巧-fluoren}dmethoxyca;rbonyl (Fmoc)-Gly-Phe-Leu-Gly(GFLG)-Iiitro地en}desterpeptide)之間的化學反應偶聯在一 起，組織蛋白酶B可特異性地水解運種多膚，從而將鏈接的化學鍵斷開，將吉西他濱釋放出 來。組織蛋白酶B在細胞內主要存在于溶酶體中，運種環境模擬了細胞內環境。納米微粒 進入胞內，被溶酶體中的組織蛋白酶水解，釋放吉西他濱，發揮抑瘤作用。如圖10所示：在 P冊.5時候，吉西他濱釋放速度及量均較PH7. 4高。腫瘤細胞代謝旺盛，使得腫瘤組織區域 呈弱酸性，根據實驗結果可知，納米藥物在腫瘤組織會更快更大量釋放，在正常組織釋放較 少，從而既可W減少對正常細胞的殺傷作用，又可W提高抑瘤效果。
[0249] 3、細胞毒性試驗
[0巧0] 如11圖所不：在不同吉西他濱濃度時，Gem,Gem-IONP,scFv-Gem-IONP， scFv-Gem-IONP/siBmi-1各組細胞毒性逐漸增強：祀向的Gem聯合siBmi-1納米用藥組 高于單用祀向Gem納米，祀向組的細胞毒性作用又強于非祀向組，運S組的細胞毒性作用 均高于單用吉西他濱藥物組。在吉西他濱濃度為1^1，6日111、6日111-10郵、3日。￥-6日111-10郵、 scFv-Gem-IONP/siBmi-1 細胞活力分別為巧8. 33% ±0. 80% )、巧4. 73% ±1.46% )、 (89. 79 % ±1.94 % )、（89. 36 % ±2.81 % )(P< 0.05) ;5yM時分別為（79. 80 % ±1.71% )、（72. 91% ±1.82% )、化2. 13% ±2.87% )、巧6. 33% ±5. 13% )(P< 0.05); 濃度為 20yM時細胞活力分別化0.67 % ±4.04% )、巧1.67% ±3.51% )、（44. 00 % ±2. 65% )、（39. 00% ±1. 73% )(P< 0. 05)。實驗結果表明，吉西他濱納米微粒和SiBmi-I 有協同抑瘤作用。
[0巧1] 4、細胞調亡試驗
[0巧2]各組細胞調亡比例：Control0%，Gem8. 46%，Gem-IONP9. 54%，scFv-Gem-IONP13. 59%，scFv-Gem-I0NP/siBmi-117. 53%。流式檢測提示吉西他濱納米微粒較吉西他濱藥 物組有更強的細胞毒性，SiBmi-I和吉西他濱有協同作用，該實驗結果與細胞毒性實驗結果 一致。
[0巧3] 5、調亡相關蛋白表達情況
[0巧4]調亡相關蛋白Bcl2 在Gem,Gem-IONP,scFv-Gem-IONP，scFv-Gem-IONP/siBmi-1 四組中表達量逐漸降低，相對表達量分別是100,巧8. 56 + 1.99)，巧2. 93 + 1.99)， (10. 77 + 1.97)。而Bax則出現遞增趨勢，相對表達量是100,（188. 65 + 11.50)， (216. 74 + 2. 96)，化68. 42 + 16. 92)。結果表明運四組處理細胞后促進細胞調亡的能力是逐 漸增強的。scFv-Gem-IONP/siBmi-1組較scFv-Gem-IONP有更強的促調亡能力，貝進一步可 W說明吉西他濱和SiBmi-I之間存在協同抑瘤作用。
[0巧5] 6、體內抑瘤實驗及組織切片免疫組化結果
[0256] 在W上實驗中，我們已證實沉默Bmi-I基因可在細胞學實驗層面抑制膜腺癌細胞 的生長，并且活體巧光成像實驗顯示祀向納米載體可將SiRNA祀向地導入到腫瘤細胞內。 并且在體外實驗驗證各藥物組Gem、Gem-IONP、scFv-Gem-IONP、scFv-Gem-IONP/siBmi-1 對膜腺癌細胞的毒性作用的影響。在此基礎上將裸鼠分組（i)PBS(control)，（ii)IP/SCR， (iii)IP/siBmi-1, (iv)scFv-IP/siBmi-1, (v)Gem, (vi)Gem-IONP, (vii)scFv-Gem-IONP, (viii)scFv-Gem-IONP/siBmi-1 (20yg/動物）。將藥物經尾靜脈注射入裸鼠體內，觀察抑 制膜腺癌細胞生長。所有處理組腫瘤均較對照組（PB巧組腫瘤小，非祀向基因治療組IP/ SiBmi-I與SCR組相比，腫瘤體積及重量降低不明顯，不具有統計學意義。但是祀向基因組 scFv-IP/siBmi-1較SCR對照組及非祀向組均有明顯降低，體積更小，重量更輕。在吉西他 濱藥物組中，祀向藥物組scFv-Gem-IONP也較非祀向藥物組Gem-IONP及單純Gem組更小、 更輕；并且共載Gem及SiBmi-I組在所有分組中體重最輕，體積最小。對PBS(Control)、 IP/SCR、IP/siBmi-1及scFv-IP/siBmi-1組腫瘤組織切片進行免疫組化染色觀察Bmi-I 基因在各組的表達。結果如圖12所示：PBS組和SCR組Bmi-I的表達量較高，IP/siBmi-1 及scFv-IP/siBmi-1表達量明顯降低，祀向組降低更多；提示祀向組和非祀向組均可W 將SiBmi-I帶入腫瘤細胞內，并且祀向組達到了更好的干擾效果。對PBS(Control)、Gem、 Gem-IONP、scFv-Gem-IONP、scFv-Gem-IONP/siBmi-1 進行Bmi-UBd-2、Bax染色。結果如 圖13所示：與其他各組相比，scFv-Gem-IONP/siBmi-1組Bmi-I表達量降低。Bcl-2的表達 量呈逐漸降低趨勢，Gem聯合SiBmi-I組的表達量最低；Bax的表達則呈現出相反的趨勢， 逐漸升高，在scFv-Gem-IONP/siBmi-1組表達量最高。與Westernblot結果一致。W上結 果提示，scFvcd44w修飾的載體可獲得高度的腫瘤特異性，增加腫瘤局部的SiRNAs濃度，增強 SiBmi-I的抗腫瘤效應；吉西他濱和SiBmi-I聯合應用有更強的協同抗腫瘤效應。
【主權項】
1. 一種用于治療胰腺癌的靶向載體，其包括： 用于靶向識別胰腺癌細胞的CD44v6單鏈抗體；以及 納米載體IONP-PEI; 其中所述CD44v6單鏈抗體與所述納米載體IONP-PEI偶聯。2. 權利要求1所述的靶向載體在胰腺癌治療中的應用。3. -種用于治療胰腺癌的納米微粒，其包括權利要求1所述的靶向載體、以及沉默 RNA，其中，所述沉默RNA搭載于所述靶向載體上。4. 如權利要求3所述的納米微粒，其中，所述沉默RNA為Bmi-I基因的沉默RNAs，即 siBmi-lo5. 如權利要求4所述的納米微粒，其進一步包括吉西他濱化療藥物，所述吉西他濱化 療藥物與所述siBmi-1共載于所述胰腺癌祀向載體上。6. 權利要求3-5之一所述的納米微粒在胰腺癌治療中的應用。7. 如權利要求6所述的應用，其中，所述納米微粒作用于胰腺癌Panc-I細胞。
【專利摘要】本發明提供了一種用于治療胰腺癌的靶向載體，其包括：用于靶向識別胰腺癌細胞的CD44v6單鏈抗體、以及納米載體IONP-PEI；其中CD44v6單鏈抗體與納米載體IONP-PEI偶聯。另一方面，本發明提供了一種用于治療胰腺癌的納米微粒，其包括前述靶向載體、沉默RNA、以及吉西他濱化療藥物，其中，沉默RNA和吉西他濱復合于前述靶向載體上。本發明構建了高效、安全、具有靶向功能的非病毒基因載體。將沉默RNA和吉西他濱通過納米載體偶聯，并且與抗CD44v6單鏈抗體偶聯，將基因治療、化療和生物靶向治療聯合應用，為抗胰腺癌新型藥物研發提供了新思路和科學依據。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/7068, A61K48/00, A61K9/14, A61K47/48, A61P1/18
【公開號】CN105169402
【申請號】
【發明人】陳茵婷, 黃開紅, 曾林涓, 李佳佳
【申請人】中山大學孫逸仙紀念醫院, 陳茵婷, 黃開紅, 曾林涓, 李佳佳
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年5月28日