骨細胞分化標記基因堿性憐酸酶（AL巧和I型膠原（ColIa1)表達的變化（圖4B)。 引物序列如下表： 陽05引表3引物序列
陽化引 （4)ALP染色：取前成骨細胞MC-3T3-E1，W5XIO^/孔的細胞數接種于24孔板中， 每組設3個復孔，轉染4化后（步驟同上），用PBS洗涂3次，每次5分鐘。采用10%中性 甲醒固定細胞，室溫15min，用PBS洗涂3次，每次5分鐘；去除洗涂液，加入適量BCIP/NBT 染色工作液，確保能充分覆蓋樣品；室溫避光解育24小時；去除BCIP/NBT染色工作液，用 =蒸水洗涂1-2次即可終止顯色反應，對染色結果進行掃描，并采用ImageJ軟件分析染 色面積（圖4C)。
[0056] 妨茜素紅S染色法檢測：取前成骨細胞MC-3T3-E1，W5X10^孔的細胞數接種于 24孔板中，每組設3個復孔，轉染4她后（步驟同上），將細胞培養基更換為誘導成骨分化培 養基（a-MEM添加 10%FBS、50]ig/ml維生素C與IOmMP甘油憐酸鋼，20pmolantagomir 每孔lul)誘導細胞成骨分化，每2d更換培養基，誘導分化21d時取出細胞，PBS清洗細 胞，采用10%中性甲醒固定細胞，室溫15min，PBS清洗細胞1次，加入0.5%茜素紅S染液 (pH4. 2)，室溫染色15min，使用自來水對細胞震蕩清洗4次，5min/次，掃描儀對著色礦化結 節進行掃描獲取圖片，義用ImageJ分析軟件（化tionalInstitutesofHealth,NIH)對 礦化結節面積進行分析（圖4D)。
[0057] 圖5表明，antagomi;r-138-5p處理后MACFl的表達明顯上調。
[0058] 實施例5:采用antagomir-138-5p轉染前成骨細胞MC-3T3-E1中，研究其對MCFl 的影響。具體步驟如下：
[0059] (1)實驗分組實驗分為空白組、陰性對照組、W及轉染miR-138-5p反義核巧酸的 轉染處理組，共3組，所有組的細胞數量及培養條件均相同。 W60] 0)轉染和qPCR檢測實驗步驟同圖4步驟。
[0061]圖6表明，antagomi;r-138-5p處理有效抑制miR-138-5p的表達（圖6A)，而且 antagomir-138-5p有效逆轉S維回轉對成骨細胞分化的抑制作用（圖6B)，并且顯著促進 MACFl W及相關通路0 -catenin的表達（圖6C)。實施例6 S維回轉下，antagomi;r-138-5p 對成骨細胞分化的影響。
[0062] 實施例6 維回轉條件下，antagomi;r-138-5p對成骨細胞分化的影響。具體步驟 如下：
[0063] 將對數生長期的MC3T3-E1前成骨細胞接種于化ticell細胞培養板上，37°C，5% C〇2,完全培養基（a -MEM添加10%FBS、1%k谷氨酷胺、100 y g/ml鏈霉素與lOOunits/ml 青霉素）培養12-24小時，待細胞匯合約70% -80%后；轉染；化后，更換為不含抗生素的 培養基；1化后，上回轉盒，更換并灌滿為新鮮的不含抗生素的培養基，排盡氣泡；回轉4她 后收樣。之后提RNA并qPCR檢測。
[0064] 表4引物序列
[0066] 圖7表明antagomir-138-5p處理后，趾長伸肌、脾腸肌、股四頭肌、比目魚肌、腔前 肌等相關的骨骼肌相對重量明顯升高。
[0067] 實施例7 :采用小鼠后肢力學去負荷模型，在尾懸吊前5天，利用能夠攜帶小核 酸特異性到達骨形成部位的祀向遞送系統（AspSerSe;r)6-liposome(ZhangG,etal,Pfet. Med. 2012)，通過尾靜脈注射antagomi;r-138-5p(lOmg/kg)，每兩天注射一次，連續3次，然 后尾懸吊28天。共分為五組：對照組、后肢去負荷組、后肢去負荷并只注射遞送系統組、后 肢去負荷并陰性對照組、后肢去負荷并轉染antagomir-138-5p的轉染處理組。脫頸處死小 鼠后，剝離取出相關的骨骼肌測量趾長伸肌、脾腸肌、股四頭肌、比目魚肌、腔前肌相對重量 變化。 W側 圖8表明，注射antagomir-138-5p處理有效促進骨形成。（圖8AMicroCT 骨重建結果圖，圖8BMicroviewV2. 1. 2分析測試相關參數結果圖）；qPCR檢測antagomi;r-138-5p抑制miR-138-5p的表達（圖 8C);qPCR檢測antagomi;r-138-5p促進 MACFl和0-catenin的表達（圖8D) ;qPCR檢測antagomi;r-138-5p促進相關成骨基因ALP、 ColIa1、骨巧素（Ocn)的表達（圖SE)。
[0069] 實施例8 :后肢力學去負荷小鼠模型中，antagomir-138-5p對承重骨骨形成的影 響。具體步驟如下：
[0070] 采用小鼠后肢力學去負荷模型，在尾懸吊前5天，利用能夠攜帶小核酸特異性到 達骨形成部位的勒!向遞送系統（AspSe;rSe;r) 6-liposome(ZhangG,etal,化t.Med. 2012)， 通過尾靜脈注射antagomi;r-138-5p(lOmg/kg)，每兩天注射一次，連續3次，然后尾懸吊 28天。共分為六組：基線組、對照組、后肢去負荷組、后肢去負荷并只注射遞送系統組、 后肢去負荷并陰性對照組、后肢去負荷并轉染antagomir-138-5p的轉染處理組。脫頸處 死小鼠后，剝離取出股骨，去除骨表面的軟組織，多聚甲醒固定后，采用MicroCT掃描，用 MicroviewV2. 1. 2分析測試W下參數：骨礦物密度，骨體積分數，骨小梁厚度，骨小梁數量 等，并進行S維重建。裂解骨組織提取RNA，采用ReattimePCR檢測骨組織中miR-138-5p 表達，W及MCFl基因與相關成骨基因ALP、ColIa1、Ocn相關通路0 -catenin的表達。
【主權項】
1. 一種力學敏感的miR-138-5p作為藥物靶點在骨骼肌肉系統疾病中應用，其特征在 于包括以下步驟： 步驟一、利用后肢去負荷小鼠動物模型，尾吊28天后，將主要承重骨股骨和脛骨剝離， 提取總RNA，在已有研究中查詢和骨形成有關的miRNAs，設計引物，利用qPCR技術檢測尾懸 吊小鼠模型中發生明顯改變的miRNAs; 步驟二、利用qPCR和Westernblot技術檢測去負荷條件下小鼠前成骨細胞MC3T3-E1 和承重骨中MACFl基因水平和蛋白水平表達的影響； 步驟三、利用TargetScan數據庫分析miR-138與MACFl的靶向關系； 步驟四、設計miR-138-5p的反義核苷酸，序列為5' -CGGCCUGAUUCACAACACCAGCU-3' ；體 外轉染反義核苷酸到小鼠前成骨細胞MC3T3-E1細胞中，利用礦化實驗、ALP染色實驗、以及 qPCR技術檢測miR-138_5p的反義核苷酸對成骨細胞的分化的影響； 步驟五、利用qPCR技術檢測體外轉染miR-138_5p反義核苷酸對MACFl的影響； 步驟六、利用三維回轉模擬體外去負荷條件，培養已經轉染miR-13 8 - 5p反義核苷 酸的小鼠前成骨細胞MC3T3-E1，之后利用qPCR技術檢測去負荷條件下，反義核苷酸 antagomir-138-5p對成骨細胞分化的影響； 步驟七、采用小鼠后肢力學去負荷模型，在尾懸吊前5天，利用能夠攜帶小核酸 特異性到達骨形成部位的靶向遞送系統6-liposome，通過尾靜脈注射反義核苷酸 antagomir-138_5p(10mg/kg)，每兩天注射一次，連續3次，然后尾懸吊28天；脫頸處死小鼠 后，剝離取出相關的骨骼肌測量趾長伸肌、腓腸肌、股四頭肌、比目魚肌、脛前肌相對重量變 化，檢測antagomir-138_5p對骨豁肌的影響； 步驟八、如步驟七，脫頸處死小鼠后，剝離取出股骨，去除骨表面的軟組織，多聚甲醛固 定后，采用MicroCT掃描，用MicroviewV2. 1. 2分析測試骨相關參數，并進行三維重建；剝 離取出股骨脛骨，采用ReattimePCR檢測antagomir-138-5p對承重骨骨形成的影響。
【專利摘要】本發明公開了一種力學敏感的miR-138-5p作為藥物靶點在骨骼肌肉系統疾病中應用。技術方案是通過調控微管微絲交聯因子1參與骨質疏松發生的microRNA，以及miR-138-5p的反義核苷酸antagomir-138-5p用于治療骨質疏松癥或其他骨骼肌肉系統疾病的用途。antagomir-138-5p在細胞和動物水平逆轉了由力學去負荷條件引起成骨細胞骨形成抑制，antagomir-138-5p通過靶向條件MACF1，促進成骨細胞分化和骨形成。調控MACF1的miR-138-5p成為骨質疏松的治療靶點，miR-138-5p的反義核苷酸antagomir-138-5p作為治療骨質疏松藥物的應用。
【IPC分類】A61K31/7088, A61P19/10, A61K48/00, A61P19/08
【公開號】CN105169411
【申請號】
【發明人】騫愛榮, 陳志浩, 亞瑟·阿爾法特, 印崇, 胡麗芳, 趙帆, 李迪杰, 張琰, 李潤芝, 蘇佩紅, 馬小莉, 仇伍霞
【申請人】西北工業大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年7月14日