檢測MCFl蛋白表達條帶。 V. S.Control, *沖<0. 01。
[0022] 圖3是【背景技術】TargetScan數據庫分析miR-138與MCFl的祀向作用圖。
[0023] 圖4是本發明應用Antagomi;r-138-5p對成骨細胞分化與礦化結節形成的促進效 果圖。A:qPCR檢測miR-138-5p，成骨分化相關基因ALP和ColIa1表達結果圖；B:ALP活 性染色結果，對染色面積進行定量統計分析；C:茜素紅S染色礦化結節圖，對礦化結節面 積進行定量統計分析；沖<0. 05, *沖<0. 01，**沖<0. 001。
[0024] 圖5是本發明應用Antagomi;r-138-5p促進MACFl基因的表達效果圖。 **沖<0. 001。
[0025] 圖6是本發明應用Antagomir-138-5p有效逆轉S維回轉對成骨細胞分化的抑制 作用圖。A:qPCR檢測miR-138-5p;B:qPCR檢測祀基因MCF1，W及相關通路0 -catenin的 表達結果圖；C:qPCR檢測成骨分化相關基因表達結果圖。沖<0. 05，*沖<0. 01，林沖<0. 001。 陽0%] 圖7是本發明應用Antagomir-138-5p有效逆轉后肢去負荷對承重骨相關肌肉的 抑制作用圖。沖<0.05，*沖<0.01。
[0027] 圖8是本發明應用Antagomir-138-5P有效逆轉后肢去負荷對承重骨骨形成 的抑制作用圖。A=MicroCT骨重建結果圖巧：用MicroviewV2. 1.2分析測試相關參數 結果圖；C:qPCR檢測miR-138-5p表達結果圖；D:qPCR檢測祀基因MCF1，W及相關通 路0-catenin的表達結果圖。E:qPCR檢測成骨分化相關基因表達結果圖。*沖<0.01， **沖<0. 001。
【具體實施方式】 陽02引參照圖1-2、4-8。圖1表明，小鼠后肢去負荷條件下有13條上調的miRNAs:miR-2 OOa-Sp, miR-183-5p, miR-2861, miR-24-3p, miR-138-5p, miR-204-5p, miR-208a-5p, miR-21 〇-3p, miR-335_5p, miR-20b_5p, miR-125a_3p, miR-13f5b-5p, miR-208a_3p; [^及一條下調的 miRNA:miR-214-3p0
[0029] 實施例I:R篩選驗證在小鼠后肢去負荷條件下發生明顯改變的miRNAs。具體步 驟是：
[0030] (1)后肢去負荷小鼠模型的構建：選用Ba化/c小鼠，用回形針懸掛于尾懸吊裝置 吊環上，小鼠脊柱與地面呈30°進行尾懸吊后肢去負荷。實驗期間動物自由進食、飲水，28 天后處死小鼠。后續取股骨采用MicroCT掃描，用Microview V2. 1. 2分析測試骨形成相關 參數。
[00川 似承重骨RNA的抽提：取Ba化/c實驗小鼠股骨和腔骨樣品，剝離干凈肌肉，用液 氮研磨骨組織，待研磨充分后，轉移到1. 5mlEP管，加入ImlTRIzol(Invitrogen公司），之 后震蕩儀混勻。4°C，12000g離屯、20min。取上清，轉移到新的1.5mlEP管。每ImlTRIzol 加入200yl的氯仿，用手上下震蕩15s，室溫放置2-3min。4°C，12000g離屯、15min。取 出EP管，樣品分為S層，將上層的水相轉移到新的1. 5mlEP管中。加入4°C預冷的異丙醇 巧OOyL/1血TRIzol),輕輕吹打混勻，沉淀RNA。-20°C冰箱靜置30min，沉淀RNA。4°C， 12000g離屯、lOmin。移去上清，緩慢沿管壁加入1血75 %乙醇，小屯、地吹打混勻。4°C，7500g 離屯、lOmin。移去上清，室溫干燥沉淀10-20min，但不可完全干燥。加入50yIRNase-化ee 的水，吹打混勻，溶解RNA。（可放置在-80°C冰箱保存）用紫外分光光度計檢測RNA在260nm 和280皿處的吸光值。根據A260/A280比值檢測所得RNA的純度，純RNA的A260/A280比 值在2.O左右（一般實驗中，運一比值最好控制在1. 7W上，2. 1W下）電泳，凝膠成像儀上 觀察結果。28S條帶與18S條帶之比應接近2:1，5S條帶不亮。
[0032] (3)qPCR篩選驗證：利用TAKARA公司的特殊miRNA反轉錄試劑盒（RR716)反轉 錄RNA，得到特殊的cDNA。之后qPCR篩選驗證在小鼠后肢去負荷條件下發生明顯改變的 miRNAs。
[0033] miRNAs的引物序列如表1。
[0034] 表1miRNAs引物序列
[0037] miRNAs引物為多聚A尾法合成，故只有一條鏈，另外一條鏈TAKARA公司的試劑盒 提供。
[0038] Real time PCR反應條件為：95°C30s，變性；95°CIOs;60°C30s，44 個循環。
[0039] 圖2表明，前成骨細胞經S維回轉處理4化后，MCFl在mRNA及蛋白水平表達明 顯下降（圖2曰，2c);同樣，小鼠后肢去負荷一尾懸吊28天明顯下調骨組織中MCFl的表達 (圖 2b，2d)。
[0040] 實施例2:用real time PCR與Western blot分別檢測S維回轉與后肢去負荷條 件對MC3T3-E1前成骨細胞與小鼠骨組織中MCFl表達的影響。具體步驟如下： 陽OW (I)RNA提取及realtimePCR檢測：MC3T3-E1前成骨細胞S維回轉4化后，采用 Trizol裂解細胞，并采用氯仿-異丙醇法提取每組細胞的總RNA，骨組織RNA提取方法見上 承重骨RNA的抽提方法。將所提取mRNA逆轉錄為cDNA，使用TAKARA試劑盒值RR037A)。逆 轉錄條件為：37°C15min;85°C15s。
[0042] 取各組的cDNA作為模板，W GAPDH作為內參，采用Real time PCR檢測MCFl的 基因表達。所用MCFl與GAPDH引物序列如下： 柳43] 表2引物序列
[0045] (2)Westernblot檢測：MC3T3-E1前成骨細胞S維回轉4她，W及小鼠后肢去負 荷一尾懸吊（28天），采用細胞裂解液裂解細胞、提取蛋白質。采用BCA法檢測蛋白濃度， 之后加上樣緩沖液，100°C加熱處理15min冰上放置2min，使蛋白變性；采用SDS-PAGE分 離蛋白，其中10 %濃縮膠，6%分離膠；將蛋白轉移至NC膜上，200V，化；5 %脫脂奶粉封閉 40min;分別加入MCFl-抗、GAPDH-抗，4°C解育過夜；TBST洗膜3次，15min/次；加入二 抗，室溫解育化；TBST洗膜 3 次，15min/ 次；用SuperSi即alWestPicoQiemiluminent Substrates進行化學發光檢測，并對X光片曝光，經顯影定影處理后，進行成像分析。
[0046] 從圖3可W發現miR-138與MACFl的3'非編碼區（3'UTR)有8個堿基互補配對， 說明miR-138與MCFl有靴向作用。
[0047] 實施例 3 :利用Tar邑etScan數據庫(http://www.targetscan.org/)預娜ImiR-138 與MCFl的靴向作用，物種為小鼠，基閑為MCFl，miR-138為目的miRNA。 W48] 圖4表明，antagomir-138-5p處理抑制miR-138-5p的表達（圖4A)，促進了成骨 分化相關基因ALP和ColIa1表達（圖4B)，增加ALP活性（圖4C)，而且顯著促進礦化結 節形成（圖4D)。
[0049] 實施例4 :采用antagomir-138-5p轉染前成骨細胞MC-3T3-E1中，研究其對成骨 細胞分化與礦化結節形成的影響。具體步驟如下：
[0050] (1)實驗分組：實驗分為空白組、轉染試劑組、陰性對照組、W及轉染miR-138-5p 反義核巧酸的轉染處理組，共4組，所有組的細胞數量及培養條件均相同。
[0051] (2)轉染：每孔的配置，取前成骨細胞MC-3T3-E1，WIXIO6/孔的細胞數接種于 6孔板中，2血含10%FBS、100yg/ml鏈霉素與lOOunits/ml青霉素10%FBS，1%心谷 氨酷胺的a-MEM細胞培養基；24小時內細胞匯合達到70-90 % ;在250y1的a-MEM無 血清培養基加入20pmolantagomir5ul柔和混勻；用250Ji1無血清的a-MEM稀釋5Ji1 Iipofectamin2000試劑，輕輕混勻，室溫放置5分鐘；將稀釋好的antagomir和RNAi-Mate 試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20分鐘，W便形成antagomir/lipofectamin復合物；將 500y1siRNA/lipofectamin復合物加到含有細胞的培養板的孔中，補加1. 5ml的-MEM無 血清培養基，來回輕柔搖晃細胞培養板。細胞在C〇2培養箱中37°C溫育4化后，進行轉染后 的其它檢測步驟。
[00巧（3)qPCR檢測：轉染4化后，義用化izol裂解細胞，并義用氯仿-異丙醇法提取每 組細胞的總RNA，將所提取mRNA逆轉錄為cDNA，利用qPCR檢測分析miR-138-5p(圖4A)W及成...