驗證miR-873在內的miRNAs在慢性嗎啡耐受過程中的動態變化（圖1)。
[0028] (2)采用LNA探針原位雜交和免疫巧光雙重標記技術檢測miR-873在脊髓背角表 達的細胞類型
[0029] 由于miRNAs分子序列太短，且同一家族的miRNA分子序列高度相似，傳統的原 位雜交探針難W穩定和特異地檢測到它的存在，因此我們擬采用Exiqon公司的鎖核酸 化ockedNucleotideAcid,LNA)探針進行miR-873分子的原位雜交。同時對脊髓背角及DRG行冰凍切片進行細胞特異性抗原（NeuN--神經元；GFAP--星形膠質細胞；Ibal--小 膠質細胞）；免疫巧光雙重標記技術。通過原位雜交和免疫巧光信號的共存來判斷發生 miRNAs表達改變的細胞類型。
[0030] (3)篩選鑒定miR-873調控的可能祀基因：生物信息學和祀基因3'-UTR體外轉染 肥K293細胞的巧光素酶檢測
[0031] miR調控的祀基因生物信息學分析及初步篩選。為獲得參與嗎啡耐受發生和維持 miRNA調控祀基因，通過生物信息學軟件分析預測了miR-873可能的祀基因。在此基礎上， 我們將根據各個祀基因3'-UTR和miR結合的序列、與慢性嗎啡耐受信息傳遞的關系等綜合 進行初步篩選，A20作為miR-873調控的祀基因（3' -UTR結合位點見圖3)。
[003引祀基因mRNA的3' -UTR轉染細胞的巧光素酶檢測（Iuciferaseassay)。
[0033] 首先將miR祀基因3' -UTR和巧光素酶基因構建成3' -UTR巧光素酶表達載體，構 建好的祀基因3' -UTR巧光素酶表達載體同miR或對照RNA序列共轉染體外培養的肥K293 細胞，檢測巧光素酶表達強度，如果共轉染miR后巧光強度減弱證明轉染的3' -UTR來自該 miR作用的祀基因的mRNA，即轉染的祀基因3' -UTR含有miR作用的祀位點。
[0034] (4)脊髓水平過表達或抑制miR-873的表達水平對慢性嗎啡耐受大鼠痛闊的影響 (疼痛行為學實驗）及其可能機制
[0035] ①抑制脊髓背角miR-873表達對嗎啡耐受大鼠行為學的影響
[0036] 預防嗎啡耐受形成：銷內注射嗎啡第Id同時銷內給予慢病毒介導miRNA干擾載 體和嗎啡，觀察嗎啡耐受大鼠銷內注射嗎啡后第3d、5d、7d的疼痛行為學變化，探討干預 miR-873表達是否可W預防嗎啡耐受形成。
[0037] ②脊髓水平干預miRNA表達對祀基因表達水平的影響。測量大鼠疼痛行為學變化 指標后，在實驗的不同時間點處死大鼠（預防嗎啡耐受形成組大鼠在注射嗎啡后第4d、7d、 IOd取材，嗎啡耐受形成后再注射miR慢病毒載體或LNA(鎖核酸）修飾的反義寡核巧酸干 預，在嗎啡耐受形成后第4d、M、IOd即注射嗎啡后第1(M、13d及16d取材），取大鼠腰膨大 L4-6段脊髓及背根神經節，檢測各時間點miRNA及祀基因產物的表達。
[00測實施例2
[0039] 慢病毒介導的miR-873干擾載體構建的具體過程：
[0040] 根據miR-873序列，利用ShRNA設計程序，按照RNA干擾序列設計原則，設計干擾 祀點序列5' -AUAAGGAUUUUUAGGGCAUUA-3';將pLenR-GPH載體（吉凱基因）兩端分別W EcoRI、BamHI為酶切位點進行酶切，使其線性化，通過T4DNA連接酶與雙鏈干擾祀點序列 進行連接反應形成ShRNA表達載體，將連接好的產物轉入制備好的感受態大腸桿菌，對長 出的克隆進行酶切鑒定，挑選陽性克隆測序，進行測序比對后，鑒定陽性的克隆即為構建成 功的shmiR-873干擾載體；
[0041] 對構建成功的shmiR-873干擾載體進行慢病毒包裝，制備慢病毒穿梭質粒及其輔 助包裝原件載體質粒，所需的載體包括：口33乂-1?6￥、口101邑-口1^6、口1026，（吉凱基因）^及所 述的構建成功的shmiR-873干擾載體，其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE慢病毒轉移質粒能表達 綠色巧光蛋白GFP，PMD2G含有病毒包裝所必需的元件；4種質粒載體分別進行高純度無內 毒素抽提，共轉染肥K293T細胞；肥K293T細胞常規培養于含lOOmL/LFBS的DMEM培養基； 轉染前Id,取對數期狀態的細胞，用膜蛋白酶消化后調整細胞密度為0.5X109個/L時，重 新接種于體積25mL的直徑15cm細胞培養皿，37°C，50mL/LC〇2培養箱內培養；當細胞密度 達培養皿60%~70%時，將4種質粒a0ug干擾載體，10.加gpMDlg-pRRE，10.加gpMD2G， 9ugpRsv-REV)加入 293. 3ulTEbuffer(0.IX，P冊.8)中，再加入 155. 6ul雙蒸水，隨后 加入50. 2ulCaClzO. 5M)混勻，隨即加入500ul2X皿S，邊滴加邊攬拌至少2min，室溫靜 置lOmin，將混合物分散逐滴加入每個孔中。將培養皿放入培養箱中（37°C，3%C02培養）； 轉染后1化更換為完全培養液繼續培養，培養4化后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液， 于4°C，4000r/min離屯、lOmin，去除細胞碎片，W0. 45ym濾器過濾，置于40血超速離屯、管 中，4°C，25000r/min離屯、20min后去上清液，W冷的PBS液分別溶于500yLDMBl和500yL PBS重懸病毒沉淀于4°C溶解過夜，用于滴度測定。
[0042] 嗎啡耐受模型及坐骨神經結扎（CCI)神經病理性疼痛模型的建立
[004引選取銷內置管成功的大鼠32只，隨機分為4組，每組8只（n= 12):生理 鹽水組（NS+NS,化am組），嗎啡耐受組（NS+MT，NS組），對照病毒加嗎啡組（control virus+mo巧hine,LV-NC組）和miR-873 慢病毒加嗎啡組（LV-shmiR-873+mo巧hine,LV-shm iR873 組）。
[0044] 參考Bennett等方法，大鼠銷內置管成功后恢復5山10%水合氯醒300mg/kg腹腔 注射麻醉后，俯邸位固定，右后肢大腿常規消毒，切開皮膚，純性分離肌肉后，暴露坐骨神經 干，顯微鏡下用4-0銘制羊腸線輕度結扎坐骨神經干，共結扎4道，間距約為1mm，結扎強度 W引起大鼠腿部肌肉輕度顫動而不影響神經外膜的血運為度，絲線逐層縫合傷口；假手術 為僅暴露坐骨神經而不結扎。
[0045] 實驗動物分組及銷內給藥
[0046] 嗎啡耐受模型：各組大鼠銷內置管成功后第3天進行銷內給藥：NS組及MT組大鼠 銷內注射10y1生理鹽水，NC組銷內注射10y1對照慢病毒（滴度：3XIO8TU)，LV組銷內 注射IOiilmiR-873陽性慢病毒（滴度：3X108TU)。銷內給藥后第3天，各組大鼠行銷內 連續給藥：NS組、LV-NC組及LV-shmiR873組大鼠連續銷內注射10y1嗎啡（1yg/y1)，每 天2次（早8 :00,晚18 :00)，共屯天；NS組大鼠用同樣的方法銷內注射10y1生理鹽水，給 藥流程見圖2。
[0047] CCI模型：成年雄性SD大鼠，銷內置管成功5d后，建立坐骨神經結扎致神經痛 (CCI)模型，隨機分為W下4組：假手術組+生理鹽水（化am組，n= 24)，化am組僅暴露右 側坐骨神經分支；CCI+生理鹽水（NS組，n= 24) ;CCI+pGCSIL-GFP空白載體組（LV-NC組， n= 32) ;CCI+pGCS比-shmiR873-GFP載體組化V-shmiR873 組，n= 32)。銷內置管成功后 第IOd即CCI術后第5d銷內分別注射NS,LV-NC或LV-shmiR873各10y1，在5~IOmin 內推完。所有大鼠均測基礎痛闊值，并在第0天、1、3、5、7天時測定大鼠右后爪機械痛闊值 (Pawwith化awalmechanicalt虹eshold，PMWT)和熱痛闊值（Pawwith化awalthermal latency,PWTL)。
[0048] 行為學實驗
[0049] 甩尾實驗（taU-flicktest):將大鼠置于平板上，福射光源正對大鼠尾部末端約 5cm處，將福射溫度設為54°C，cut-off時間設為20s，W避免大鼠組織損傷。待大鼠固定放 置5min后，開始測量。大鼠感到疼痛時即進行甩尾，此時機器自動記錄下甩尾時間。每隔 IOmin測量一次，共3次，取其平均值。甩尾實驗在銷內給藥后第1，3,5,7天的早上給藥前及 給藥后30min各測量一次。將給藥前的甩尾時間作為基礎時間，給藥后的甩尾時間作為效 應時間，嗎啡的鎮痛效能通過最大可能效能百分比來（percentofthemaximumpossible effect, %MP巧表示，其計算方法為[%MPE=(效應時間基礎時間）/(cut-off時間基礎 時間）X100]。
[0050] 痛闊的測定
[0051] 分別于CCI術前Id(基礎值）及術后5d時（重組慢載體注射前）的方法測大鼠 機械痛闊值（PMWT)和熱痛闊值（PWTL)。CCI術后5d測完痛闊后，對符合要求的CCI大鼠 銷內注射載體或者空白載體各10y1，然后在載體注射后第1天、3天、5天和7天時測PMWT 和PWTL。測大鼠機械痛闊值時將動物放入測試籠中，待動物適應環境安靜后，使用探針觸 向大鼠右側后爪，大鼠縮腿時記錄屏幕上壓力大小，即為大鼠PMWT，要求連續重復測定3次 (每次間隔5min)，取平均值。測熱痛闊時將大鼠置于測試盒內，待動物適用安靜后，固定強 度的直射光源玻璃板底面垂直對準大鼠一側后肢足巧部中后1/3處，大鼠出現縮腿的時間 記錄為大鼠PW化，每只大鼠足部測定3次，每次間隔5min，取其平均值。實驗大鼠的基礎痛 闊為6sec左右，設定切斷時間為20sec，W防止大鼠組織熱灼傷。
[00閲免疫巧光
[0053] 大鼠最后一次給藥后經升主動脈灌注固定大鼠，取脊髓腰膨大，4%多聚甲醒固 定后，薦糖梯度脫水，冰凍切片，切片厚度lOum。染色步驟：憐酸鹽緩沖液（PB巧清洗切 片，5minX2次，10%驢血清室溫封閉比，不洗，分別加入一抗：兔抗A20(l:1〇〇〇)、小鼠抗 CGRPQ:200)、兔抗GFPQ:200)、小鼠抗化uN(l:200),4°C解育過夜，PBS清洗，IOminX3 次，分別滴加巧光二抗驢