抗兔Alexa488 (1:400)，驢抗小鼠Alexa594(1 :400)室溫避光解 育2h，PBS洗IOminXS次后甘油封片，巧光顯微鏡在Alexa594及Alexa488相應最適波 長拍照記錄。
[0054] Westernblot
[00巧]最后一次給藥后大鼠斷頭處死，冰上取新鮮大鼠脊髓腰膨大。采用RIPA提取全蛋 白，BCA法測定蛋白質濃度。取50yg蛋白樣品上樣，10%凝膠電泳（SDS-PAGE) ,80-120V 電泳90111111，？￥0。膜行濕法轉膜，250減轉膜50111111。5%牛奶封閉比，滴加一抗兔抗420(1: 1000)，兔抗GAPDH(1 :1500)，一抗4°C解育過夜，TBST洗IOminX3次，滴加過氧化物酶標記 的山羊抗兔二抗（1 :2000)，解育一個半小時，TBST洗IOminX3次，E化發光顯影。如antity 化e軟件進行分析。
[0056] Real-timePCR
[0057] 參考文獻，由PrimePrimier510軟件設計引物如下：
[0058] 祀基因A20 上游引物：5' -CACACAAGGCACTTGGATCC-3'，下游引物 5' -TCCCCAGGAGTCCGTGCAGC-3'。各組大鼠最后一次給藥后斷頭處死，新鮮取脊髓腰膨大。 采用Trizol法提取組織RNA，由RNA逆轉錄合成cDNA條件如下：25°CIOmin, 42°C60min， 85°C5min。后進行擴增反應，94°C4min、94°C20s、60°C30s、72°C30s循環 35 次。利用 AACt法進行分析，并計算出相對表達量。
[00則統計分析
[0060] 統計采用SPSS19. 0統計軟件分析，實驗數據W均數+標準差（黏g)表示。行為 學實驗用重復測量two-wayANOVA進行比較，兩組數據用兩獨立樣本t檢驗進行比較，多組 實驗數據用one-wayANOVA進行分析，P<0. 05表示差異有統計學意義。
[0061] 實驗結果
[0062] miR-873在內的脊髓背角差異表達及結合的祀基因
[0063] 嗎啡耐受組（NS組）和生理鹽水對照組（化am組）包括miR-873在內的脊髓背角 差異表達miRNART-qPCR驗證結果。可見miR-873表達在NS組顯著上調（P<0. 05KmiR-873 的序列圖及分別同祀基因A20的3' -UTR結合位點圖。miR-873:length= 2化p。（圖1，3)。
[0064] 甩尾試驗
[006引 NS組大鼠各時間點％MPE無明顯變化；NS組大鼠％MPE第1天升高，第3天開始 下降，至第7天與NS組相比無統計學差異（P〉0. 05);說明嗎啡耐受模型建立成功。LV-NC組大鼠％MPE變化與NS組相似；LV-shmiR873組大鼠其％MPE在第1、3天變化與MT組及 control組相似，差異無統計學意義（P〉0. 05)，第5至第7天，其％M陽值仍維持在80 %W 上，明顯高于其他S組，差異有統計學意義（P<0. 05)。說明嗎啡對LV-shmiR873組大鼠仍有 較強鎮痛效能，LV-shmiR873組大鼠與其他S組相比未形成嗎啡耐受。（圖4)
[0066] 銷內注射重組慢病毒載體LV-shmiR-873減輕大鼠機械痛闊及熱痛闊
[0067] 銷內注射重組慢病毒載體后，對大鼠疼痛行為學觀察持續了 7天。與NS組及LV-NC 組比較，LV-shmiR-873 (IOyl)顯著增加1~7天PMWT和PWll值。差異有統計學意義 (P<0. 05)。NS組及LV-NC組大鼠PMWT和PWll值沒有變化（見圖5)。
[0068] 慢病毒轉染結果
[0069] 我們利用免疫巧光實驗檢測慢病毒介導的shmiR-873的表達情況。通過免疫巧光 實驗，我們發現LV-shmiR-873成功轉染至脊髓中（圖6)。
[0070] Westernblot及Real-timePCR結果
[0071] 我們利用Westernblot實驗（WB)在蛋白水平對脊髓中A20的表達進行測定，結 果發現：LV-shmiR873組大鼠其脊髓中A20蛋白表達水平與NS組及LV-NC組相比均上調 (P<0. 05)，我們通過RT-PCR實驗在RNA水平對脊髓中A20的表達變化進行觀察，同樣發現 LV-shmiR873組其A20mRNA表達量與LV-NC組相比上調（P<0. 05)(圖7)。
【主權項】
1. 一種內源性的非編碼小RNAmiR-873的應用，其特征在于，制備用于治療 或者緩解慢性疼痛及嗎啡耐受的藥物，所述的非編碼小RNAmiR-873的序列為： GCAGGAACU腳GA⑶CUCCU〇2. 根據權利要求1所述的內源性的非編碼小RNAmiR-873的應用，其特征在于，用于治 療或者緩解慢性疼痛及嗎啡耐受的藥物包括：慢病毒介導的miR-873干擾載體。3. 根據權利要求2所述的內源性的非編碼小RNAmiR-873的應用，其特征在于，根據 miR-873序列，利用shRNA設計程序，按照RNA干擾序列設計原則，設計干擾靶點序列；將載 體進行酶切，使其線性化，通過T4DNA連接酶與雙鏈干擾靶點序列進行連接反應形成shRNA 表達載體，將連接好的產物轉入制備好的感受態大腸桿菌，對長出的克隆進行酶切鑒定，挑 選陽性克隆測序，進行測序比對后，鑒定陽性的克隆即為構建成功的shmiR-873干擾慢病 毒載體；然后對構建成功的shmiR-873干擾載體進行慢病毒包裝。4. 根據權利要求3所述的內源性的非編碼小RNAsmiR-873的應用，其特征在于，慢病毒 介導的miR-873干擾載體構建的具體過程： 根據miR-873序列，利用shRNA設計程序，按照RNA干擾序列設計原則，設計干擾靶點 序列 5' -AUAAGGAUUUUUAGGGCAUUA-3' ；將pLenR-GPH載體兩端分別以EcoRI、BamHI為酶 切位點進行酶切，使其線性化，通過T4DNA連接酶與雙鏈干擾靶點序列進行連接反應形成 shRNA表達載體，將連接好的產物轉入制備好的感受態大腸桿菌，對長出的克隆進行酶切鑒 定，挑選陽性克隆測序，進行測序比對后，鑒定陽性的克隆即為構建成功的shmiR-873干擾 載體； 對構建成功的shmiR-873干擾載體進行慢病毒包裝，制備慢病毒穿梭質粒及其輔助 包裝原件載體質粒，所需的載體包括：pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G以及所述的構建成功 的shmiR-873干擾載體，其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE慢病毒轉移質粒能表達綠色熒光蛋白 GFP，pMD2G含有病毒包裝所必需的元件；4種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提，共 轉染HEK293T細胞；HEK293T細胞常規培養于含100mL/LFBS的DMEM培養基；轉染前ld， 取對數期狀態的細胞，用胰蛋白酶消化后調整細胞密度為0. 5XIO9個/L時，重新接種于 體積25mL的直徑15cm細胞培養皿，37°C，50mL/L0)2培養箱內培養；當細胞密度達培養皿 60%~70%時，將IOug干擾載體，10.5ugpMDlg-pRRE，10.5ugpMD2G，9ugpRsv-REV加入 293.3111 口118.8的0.1\了￡131^€61中，再加入155.6111雙蒸水，隨后加入50.21112.51的 〇&〇1 2混勻，隨即加入50〇1112\耶3，邊滴加邊攪拌至少21^11，室溫靜置1〇111111，將混合物分 散逐滴加入每個孔中；將培養皿放入培養箱中37°C，3%CO2培養；轉染后12h更換為完全 培養液繼續培養，培養48h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，于4°C，4000r/min離心 lOmin，去除細胞碎片，以0. 45ym濾器過濾，置于40mL超速離心管中，4°C，25000r/min離 心20min后去上清液，以冷的PBS液分別溶于500yLDMEM和500yLPBS重懸病毒沉淀于 4 °C溶解過夜。5. 根據權利要求1-4任一項所述的內源性的非編碼小RNAmiR-873的應用，其特征在 于，miR-873通過調控靶基因A20參與嗎啡耐受的發生和維持。6. 根據權利要求5所述的非編碼小RNAmiR-873的應用，其特征在于，靶基因A20通過 負向調節膠質細胞在嗎啡耐受條件下脊髓釋放的促炎因子TNFa參與炎癥形成。7. -種內源性的非編碼小RNAMiR-873的應用，其特征在于，miR-873用于調控A20基 因，所述的非編碼小RNAs miR-873的序列為：GCAGGAACUUGUGAGUCUCCU。8. -種內源性的非編碼小RNA MiR-873的應用，其特征在于，miR-873用于制備調控 A20基因的制劑，所述的非編碼小RNAs miR-873的序列為：GCAGGAACUUGUGAGUCUCCU。9. 一種內源性的非編碼小RNA MiR-873的應用，其特征在于，miR-873用于調控膠質細 胞在嗎啡耐受條件下脊髓釋放的促炎因子TNF a，從而參與炎癥形成，所述的非編碼小RNAs miR-873 的序列為：GCAGGAACUUGUGA⑶CUCCU。10. -種內源性的非編碼小RNA MiR-873的應用，其特征在于，miR-873用于制備嗎啡 耐受條件下脊髓釋放的促炎因子TNF a的調控制劑，所述的非編碼小RNA miR-873的序列 S:GCAGGAACUUCTJGACTJCUCCU〇
【專利摘要】本發明提供了一種內源性的非編碼小RNA？miR-873的應用。尤其是miR-873在用于治療或者緩解慢性疼痛及嗎啡耐受的藥物上的應用。此外，還可以用于制備調控A20基因的制劑，以及用于制備嗎啡耐受條件下脊髓釋放的促炎因子TNFα的調控制劑。本發明證實miR-873通過調控TNFα誘導蛋白-3(A20)參與嗎啡耐受形成，為miR-873在治療或緩解慢性疼痛及嗎啡耐受藥物上的應用打下重要基礎。
【IPC分類】A61P29/00, A61K48/00
【公開號】CN105169413
【申請號】
【發明人】鄒望遠, 王健, 郭曲練, 宋宗斌
【申請人】中南大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月13日