用PBS清洗5次，再膜酶 消化、離屯、，最后分散在ImLPBS(含0.5%瓊脂糖）中，用臨床核磁共振成像體系（3.OT)評 價腫瘤部位的MR成像效果。在圖9a中，隨著化濃度的增加，化3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA 納米顆粒處理后的細胞均表現出MR圖像信號衰減的趨勢，說明隨著化濃度的增加，細胞對 納米顆粒的吞隧量也增加。需要指出的是，在相同的化濃度下，Fe3〇4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA 納米顆粒處理后的ASGPRs高表達的化pG2細胞（見圖9a(l))比ASGPRs低表達的化pG2 細胞（見圖9a似）的MR圖像信號降低更明顯，說明ASGPRs高表達的HepG2細胞對化化/ 陽I.NHAc-FI-PEG-LA納米顆粒的吞隧量要大大高于ASGPRs低表達的化pG2細胞對納米顆 粒的吞隧量。圖9b是細胞經過不同濃度的納米顆粒處理后的ASGPRs高低表達的化pG2細 胞的MR圖像信號值，從圖中明顯看出，隨著化濃度的增加，細胞的MR圖像信號值均逐漸 降低。而在相同的化濃度下，FesCV陽I.NHAc-FI-PEG-LA納米顆粒處理后ASGPRs高表達 的HepG2細胞的MR圖像信號值要明顯低于ASGPRs低表達的HepG2細胞的MR圖像信號值 (p<0. 001)。運些結果不僅說明本發明制備的化3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA納米顆粒具有很 好的細胞MR成像效果，而且證明了化3O4/陽I.NHAc-FI-PEG-LA納米顆粒對ASGPRs高表達 的化pG2細胞的特異祀向能力。
[0066] 實施例11
[0067] 年齡4~6周的雄性裸鼠麻醉后，將化pG2細胞W3XIO6細胞/只的密度種植于 裸鼠的后肢部位。3~4周后，將腫瘤取出切成1皿3的碎片，通過手術將其種植于其他裸 鼠的肝臟部位。再經過3-4周的飼養，荷瘤鼠建模形成（形成體積為0.8-1. 4cm3的肝腫 瘤），并將其分成兩組，用于驗證本發明制備的化3O4/PEI.NHAc-FI-PEG-LA納米顆粒（實 施例5)對腫瘤的祀向特異性。兩組肝癌裸鼠分別直接尾靜脈注射本發明制備的化3〇4/ 陽I.NHAc-FI-PEG-LA納米顆粒（見附圖IOa,Group1)和混有游離LA(ImM)的化化/PEI. NHAc-FI-PEG-LA納米顆粒（見附圖10曰，Group2)(化的質量為500yg，0. 1血）的PBS溶液， 然后用臨床核磁共振成像體系（3.OT)評價腫瘤部位的MR成像效果。與注射前的對照組相 比較，在注射后0. 5小時，兩組腫瘤部位均開始變暗，2個小時達到最暗。在注射4小時后， 兩個實驗組的裸鼠腫瘤部位明暗程度都逐漸恢復，說明此時納米材料隨著血液循環已經從 腫瘤部位逐漸代謝出去（圖IOa)。圖1化表示相應注射時間的腫瘤MR圖像信號值變化，在 注射0. 5小時后，兩組裸鼠腫瘤部位的信號強度均降低，2個小時信號強度候達到最低。在 注射4小時后，兩組裸鼠腫瘤部位MR圖像信號值均有所增加，運與圖IOa的結果一致。值得 一提的是，圖IOa和圖1化均表明：隨著時間的推移，僅注射化3〇4/陽I.NHAc-FI-PEG-LA納 米顆粒的裸鼠腫瘤MR圖像信號強度（Group1) -直低于注射混有游離的LA的化3O4/PEI. NHAc-FI-PEG-LA納米顆粒的裸鼠腫瘤MR圖像信號強度（Group2) (p<0. 01)。運些結果說 明本發明制備的FesCyPEI.NHAc-FI-PEG-LA納米顆粒具有很好的腫瘤祀向能力，能成功應 用于體內祀向MR腫瘤成像診斷。
【主權項】
1. 一種乳糖酸修飾的超小型超順磁四氧化三鐵納米顆粒的制備方法，包括： (1) 將三價鐵鹽溶于超純水中，氮氣鼓吹，加入亞硫酸鈉溶液，反應30~40分鐘，依次 加入超支化聚乙烯亞胺PEI水溶液和NH3 ?H20,60~70°C下恒溫攪拌反應30~40分鐘； 然后在室溫下反應1. 5~3小時，將產物磁分離，洗滌，得到PEI包裹的超小型超順磁四氧 化三鐵納米顆粒Fe304/PEI.NH2;其中，三價鐵鹽、亞硫酸鈉和PEI的質量比為1. 2~1. 4 : 0. 20~0. 25 :0. 50~0. 53 ;三價鐵鹽、超純水和NH3 .H2O的配比為1. 2~I. 4g:20~25mL: 2 ~3mL; (2) 將步驟（1)中的Fe304/PEI.MV冼滌，分散于溶劑中，然后加入FI溶液，攪拌，磁分 離，洗滌，分散于水中，得到FeA/PEI.NH2-FI納米顆粒水溶液；其中，FeA/PEI.順2中的 PEI和FI的摩爾比是I: 10~15 ; (3) 將LA與EDS和NHS混合溶于磷酸鹽緩沖溶液PBS中，攪拌活化，加入到 COOH-PEG-My^PBS溶液中，攪拌2~4天，透析，真空冷凍干燥，得到C00H-PEG-LA;其中， LA與COOH-PEg-NH2的摩爾比是1~L5 :1 ; (4) 將步驟（3)中的C00H-PEG-LA與EDC和NHS混合溶于水中，攪拌活化，然后加入到 步驟⑵中的得到FeA/PEI.NH2-FI納米顆粒水溶液中，攪拌2~4天，磁分離，洗滌，分散 于水中，得到Fe304/PEI.NH2-FI-PEG-LA納米顆粒水溶液；其中，C00H-PEG-LA和Fe304/PEI. NH2-FI中PEI的摩爾比是15~20 :1 ; (5) 將三乙胺加入到步驟⑷中Fe304/PEI.NH2-FI-PEG-LA納米顆粒水溶液中，攪 拌20~40分鐘，然后加入乙酸酐，攪拌20~30小時，磁分離，洗滌，得到FeA/PEI. NHAc-FI-PEG-LA納米顆粒；其中，三乙胺、乙酸酐和Fe304/PEI.NH2-FI-PEG-LA上PEI伯胺的 摩爾比是5~10 :5~10 :1。2. 根據權利要求1所述的一種乳糖酸修飾的超小型超順磁四氧化三鐵納米顆粒的制 備方法，其特征在于，所述步驟（1)中三價鐵鹽為FeCl3 ? 6H20。3. 根據權利要求1所述的一種乳糖酸修飾的超小型超順磁四氧化三鐵納米顆粒的制 備方法，其特征在于，所述步驟（2)中溶劑為DMSO,FI溶液的溶劑為DMS0。4. 根據權利要求1所述的一種乳糖酸修飾的超小型超順磁四氧化三鐵納米顆粒的制 備方法，其特征在于，所述步驟（2)中攪拌的時間為1~2天。5. 根據權利要求1所述的一種乳糖酸修飾的超小型超順磁四氧化三鐵納米顆粒的制 備方法，其特征在于，所述步驟（3)中LA、EDS和NHS的摩爾比為1~1.5 :1~1.5 :1~ 1. 5〇6. 根據權利要求1所述的一種乳糖酸修飾的超小型超順磁四氧化三鐵納米顆粒的制 備方法，其特征在于，所述步驟（3)中PBS溶液的pH值為6. 0。7. 根據權利要求1所述的一種乳糖酸修飾的超小型超順磁四氧化三鐵納米顆粒的制 備方法，其特征在于，所述步驟（4)中C00H-PEG_LA、EDC和NHS的摩爾比是1 :8~10 :8~ 10。8. 根據權利要求1所述的一種乳糖酸修飾的超小型超順磁四氧化三鐵納米顆粒的制 備方法，其特征在于，所述步驟（3)和步驟（4)中攪拌活化的時間為2~4h。
【專利摘要】本發明涉及一種乳糖酸修飾的超小型超順磁四氧化三鐵納米顆粒的制備方法，包括：將三價鐵鹽與亞硫酸鈉反應后加入超支化聚乙烯亞胺和氨水，反應后加入FI，得Fe3O4/PEI.NH2-FI；LA經EDS和NHS活化，加到COOH-PEG-NH2的溶液中，反應得COOH-PEG-LA；COOH-PEG-LA經EDC和NHS活化，加到Fe3O4/PEI.NH2-FI中，反應后經乙酰化即得。本發明的方法簡單，反應條件溫和，易于操作；制備的納米顆粒粒徑較小、弛豫率很高，并且具有良好的膠體穩定性、生物相容性和特定的去唾液酸糖蛋白受體高表達腫瘤細胞的靶向性，在體內腫瘤靶向MR成像診斷領域具有潛在的應用價值。
【IPC分類】A61K49/18, A61K49/12
【公開號】CN105169418
【申請號】
【發明人】沈明武, 胡勇, 史向陽
【申請人】東華大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月12日