黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及藥物化學及生物醫藥技術領域，具體涉及一種黃綠蜜環菌中染料木素 單體化合物的提取方法，以及該染料木素單體化合物在制備抗肝癌藥物和抗肺癌藥物中的 應用。
【背景技術】
[0002] 黃綠蜜環菌（Armillarialuteo-rivens)，又名黃蘑燕、金蘑燕、黃環菌，隸屬于擔 子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、蜜環菌屬。黃綠蜜環菌子實體中等大，菌蓋扁半球形至 平展，直徑5-12cm，菌蓋邊緣內卷，表皮開裂形成近環狀排列的纖毛狀后磷片。菌褶近似菌 蓋色，稍密，彎生，不等長。菌柄柱形，莖部膨大，長2-lOcm，直徑2-2. 5cm，白色或或帶黃色， 內實。菌環中位，單層，菌環以上為白色，菌環以下為黃色鱗片。在顯微鏡下觀察，擔孢子橢 圓形，無色至微黃色，淀粉質，擔孢子棒狀，無色，具4個孢子，菌絲具明顯鎖狀聯合。菌絲分 布在土壤5-lOcm。該菌夏秋季生于針葉林地或草地上，尤其喜生于高山草地上，菌絲可與主 要植被為嵩草和高山雜類草等形成菌根。在牧草生長季節，由黃綠蜜環菌菌絲頂端生長，在 草地上形成或大或小的圓圈、半圓或條帶狀的蘑菇圈。圈的寬度大約為50cm，圈的直徑大約 6cm左右（周連玉.黃綠蜜環菌的研究概述.安徽農學通報[J]. 2010, 16 (3): 52-54)。
[0003] 國內對黃綠蜜環菌營養成分進行了初步分析，富含氨基酸、蛋白質、多糖多 肽等營養和藥用成分，具有較高的保健和藥用價值。但目前的蜜環菌制劑主要以初 提混合物為原料，如郭順星等在"蜜環菌的化學成分及應用研究"（微生物學通報 [J]· 1996,23(4):239-240)中提出：蜜環菌糖漿以蜜環菌培養液（菌絲連同發酵液）為主 要原料，煮沸濃縮制成，主治眩暈頭痛，神經衰弱，失眠，美尼爾綜合癥；蜜環菌浸膏以菌絲 體為原料，煮沸、過濾，殘渣醇析，醇析物與濾液合并濃縮制成，用于治療血管性頭痛、神經 衰弱、冠心病、腦動脈血管硬化等病；蜜環菌片以菌絲體烤干后磨成細粉壓片而成，對高膽 固醇血癥、高甘油三酯血癥、降低血壓有一定效果。由于蜜環菌制劑成分一般為混合物，缺 乏必要的藥效物質基礎和藥效研究，所以其缺乏合理的質量控制標準，難以確保臨床用藥 的有效性、安全性、可持續性。可見，對黃綠蜜環菌的化學成分進行進一步提取和研究非常 有必要。
[0004] 袁興利等在"蜜環菌的化學成分研究"（中國中藥雜志 [J]. 2013, 38(16) :2671-2674)提出以蜜環菌發酵培養物（包含菌絲體和發酵液）為原料進 行有效成分提取：采用95%乙醇浸提后，用閃式提取器提取，合并提取液并濃縮；經兩次硅 膠柱色譜和一次Sephadex LH-20色譜柱，并使用不同的洗脫劑進行分離純化后，得到染料 木素（化學名化學名5, 7, 4' -三羥基異黃酮；金雀異黃酮）單體化合物。但是使用該方法 步驟繁瑣，成本高，得到的染料木素含量少，得率比較低，3. 5kg干燥的蜜環菌發酵培養物只 得到42mg染料木素，這大大限制了染料木素的進一步研究和應用。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種黃綠蜜環菌中 染料木素單體化合物的提取方法，該方法采用二維高效液相色譜進行分離純化，得到具有 生物活性的染料木素單體化合物，分離方法穩定，重復性高，制備量大，操作簡單省時，成本 低，染料木素提取率尚。
[0006] 本發明所采用的技術方案為：
[0007] -種黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取方法，該方法包括以下步驟：
[0008] (1)以黃綠蜜環菌子實體為原料，經干燥并磨成粉末狀后，用乙酸乙酯以液固比 (5_10)mL : lg進行浸泡，然后過濾取上清，得到乙酸乙酯提取液，并濃縮至膏狀；
[0009] (2)使用乙醇體積分數為10-35%的正己烷-乙醇二元混合溶劑溶解步驟（1)得 到的膏狀乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上樣溶液；
[0010] (3)對上樣溶液進行一維液相色譜分離：采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜 柱，采用的流動相為二元混合有機相，其中A相為正己烷，B相為乙醇，進樣量為50-150mL/ 針，流動相流速為550-600mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210-260nm ;采用的洗脫 方式為B相濃度由0%至75% (即按體積百分比B相75%、A相25%混合而成的液體，其 他同理）進行梯度洗脫45-50min，根據紫外吸收光譜收集26-29min洗脫液作為目的組分， 減壓濃縮至膏狀，得到一維液相組分；
[0011] (4)用乙醇體積分數為2-15 %的乙醇-正己烷二元混合溶劑溶解一維液相組分， 溶解至濃度為50-100mg/mL ;
[0012] (5)進行二維液相色譜分離：采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱，采用的流 動相為二元混合有機相，其中A相為正己烷，B相為乙醇，進樣量為500-2000 μ L/針，流動 相流速為10_30mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210-260nm，采用的洗脫方式為等 度洗脫方式，B相濃度2%進行等度洗脫15-20min，根據紫外吸收光譜收集8-1 lmin洗脫液 作為目的組分，旋轉蒸發濃縮至干，得到染料木素單體化合物。
[0013] 所述步驟（3)中的Silica正相硅膠色譜柱的尺寸為直徑150mm、柱長250mm，其中 硅球粒徑為10~50 μ m，使用時柱溫為室溫或25-40 °C。
[0014] 所述步驟（5)中的Silica正相硅膠色譜柱的尺寸為直徑20mm、柱長250mm，其中 硅球粒徑為10~50 μ m，使用時柱溫為室溫或25-40 °C。
[0015] 本發明還進一步提供上述提取得到的染料木素單體化合物在制備抗肺癌藥物中 的應用。該染料木素單體化合物作為有效成分，按常規方法如口服、注射，與藥學上的可接 受載體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如：片劑、膠囊、注射劑等。
[0016] 本發明進一步提供上述提取得到的染料木素單體化合物在制備抗肝癌藥物中的 應用。該染料木素單體化合物作為有效成分，按常規方法如口服、注射，與藥學上的可接受 載體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型，如：片劑、膠囊、注射劑等。
[0017] 本發明采用二維液相色譜技術進行從黃綠蜜環菌中分離純化染料木素：
[0018] 首先：由于染料木素為苷元，極性非常小，所以粗提選用乙酸乙酯進行相似相溶提 取，該溶劑可以盡可能多地溶解目的組分，且乙酸乙酯為脂溶性溶劑，與其相似相溶的目的 組分也應該具備進入生物活性細胞所必需的脂溶性特性，從而具有更高的進入細胞參與細 胞內作用的可能性；
[0019] 其次，在一維分離的條件選擇上：多次試驗結果顯示，Silica正相硅膠色譜柱對 所提物質分離效果較好，而通過考察不同流動相組成和不同洗脫方式、流速及進樣量后，結 果顯示采用本發明乙醇-正己烷0% -75%梯度洗脫分離效果最佳，且進樣量在50-150mL/ 針范圍內、流動相在550-600mL/min范圍內時重復性良好，得到的一維液相組分中目的峰 清晰、無拖尾/吸收等現象，與其他峰之間分離好，有利于分離操作和后續進一步提純；
[0020] 再次，在二維分離的條件選擇上：由于一維得到的組分中目的化合物含量已相當 高，再使用Si 1 ica正相硅膠色譜柱，在洗脫條件選擇為B相濃度2 %等度洗脫時能將極性與 染料木素接近的雜質分離開，得到純度可達95%以上的染料木素單體化合物。