中國醫學科學院血液病醫院提供；F-12K培養基購自Life Technologies Corporation ;iCELLigence實時無標記細胞功能分析儀購自艾森生物（杭 州）有限公司；DMS0購自天津康科德科技有限公司。
[0087] 細胞培養：
[0088] 在5 % C02、37°C飽和濕度下，用F-12K (10 % FBS+1 % PS)培養基培養人肺腫瘤A549 細胞，選取對數期生長的細胞作為實驗細胞。細胞計數后用培養基稀釋為一定濃度的細胞 懸液。
[0089] 細胞生長情況監測：
[0090] 將細胞實時監測儀放入37°C、5% C02飽和濕度培養箱中。取八孔板，每孔加入 150 μ LF-12K培養基，放入細胞實時監測儀中走基線，走完基線后取出八孔板，每孔加入稀 釋好的Α549細胞懸液345 μ L，至每孔細胞數約2 X 104個，靜置3min，在倒置顯微鏡下觀察 細胞是否均勻。每孔加入5 μ 1稀釋好的藥物（實施例1得到的染料木素單體化合物）至 終濃度為25 μ g/ml，含1%。DMS0的培養基作為空白對照組，放入細胞實時監測儀中檢測，檢 測完畢時拍照記錄。
[0091] 空白對照孔（DMS0):不加藥物，加1%〇DMS0 ;
[0092] 實驗孔（HMG7. 5):加實施例1所得的染料木素單體化合物。
[0093] 試驗結果如圖14所示。
[0094] 結果表明：本發明目的組分染料木素在25 μ g/ml時對A549細胞生長具有較強的 抑制作用。
[0095] 實施例6 :抑制人肝腫瘤Η印-G2細胞生長的試驗
[0096] 主要材料與試劑：
[0097] 人肝腫瘤Η印-G2細胞由中國醫學科學院血液病醫院提供；MEM培養基購自Life Technologies Corporation ;iCELLigence實時無標記細胞功能分析儀購自艾森生物（杭 州）有限公司；DMS0購自天津康科德科技有限公司。
[0098] 細胞培養：
[0099] 在5% C02、37°C飽和濕度下，用MEM(10% FBS、1 % PS)培養基培養人肺腫瘤Η印-G2 細胞，選取生長狀態良好的細胞作為實驗細胞。細胞計數后用培養基稀釋為一定濃度的細 胞懸液。
[0100] 細胞生長情況監測：
[0101] 將細胞實時監測儀放入5% C02、37°C飽和濕度培養箱中。取八孔板，每孔加入 150 μ LMEM培養基，放入細胞實時監測儀中走基線，走完基線后取出八孔板，每孔加入稀釋 好的Η印-G2細胞懸液345 μ L，至每孔細胞數約4 X 104個，靜置3min，在倒置顯微鏡下觀察 細胞是否均勻。每孔加入5 μ L稀釋好的藥物（實施例1得到的染料木素單體化合物）至 終濃度為所需藥物濃度（25 μ g/ml)，含1%。DMS0的培養基作為空白對照組，放入細胞實時 監測儀中檢測，檢測完畢時拍照記錄。
[0102] 空白對照孔（DMS0):不加藥物，加入1%。DMS0 ;
[0103] 實驗孔（HMG7. 5):加實施例1所得的染料木素單體化合物。
[0104] 實驗結果如圖15所示。
[0105] 結果表明：本發明目的組分染料木素在25 μ g/ml時對能Η印-G2細胞具有較好的 抑制作用。
[0106] 以上試驗結果顯示了本發明制備得到的染料木素具備良好的生物活性，具有進一 步開發有效抗腫瘤藥物方面的潛力，可以用于制備抗肺癌藥物和抗肝癌藥物。
[0107] 本發明實施例涉及到的材料、試劑和實驗設備，如無特別說明，均為符合中藥提取 的市售產品。
[0108] 以上所述，僅為本發明的優選實施例，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明的核心技術的前提下，還可以做出改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 屬于本發明的專利保護范圍。與本發明的權利要求書相當的含義和范圍內的任何改變，都 應認為是包括在權利要求書的范圍內。
【主權項】
1. 一種黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 以黃綠蜜環菌子實體為原料，經干燥并磨成粉末狀后，用乙酸乙酯以液固比 (5-10)mL : lg進行浸泡，然后過濾取上清，得到乙酸乙酯提取液，并濃縮至膏狀； (2) 使用乙醇體積分數為10-35%的正己烷-乙醇二元混合溶劑溶解步驟（1)得到的 膏狀乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上樣溶液； (3) 對上樣溶液進行一維液相色譜分離：采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱，采 用的流動相為二元混合有機相，其中A相為正己烷、B相為乙醇，進樣量為50-150mL/針，流 動相流速為550-600mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210-260nm ;采用的洗脫方式 為B相濃度由0 %至75 %進行梯度洗脫45-50min，根據紫外吸收光譜收集26-29min洗脫液 作為目的組分，減壓濃縮至膏狀，得到一維液相組分； (4) 用乙醇體積分數為2-15%的乙醇-正己烷二元混合溶劑溶解一維液相組分，溶解 至濃度為50-100mg/mL ; (5) 進行二維液相色譜分離：采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱，采用的流動相 為二元混合有機相，其中A相為正己烷、B相為乙醇，進樣量為500-2000 μ L/針，流動相流 速為10-30mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長210-260nm，采用的洗脫方式為Β相濃度 2 %進行等度洗脫15-20min，根據紫外吸收光譜收集8-1 lmin洗脫液作為目的組分，旋轉蒸 發濃縮至干，得到染料木素單體化合物。2. 根據權利要求1所述的黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取方法，其特征在 于：所述步驟（3)中的Silica正相硅膠色譜柱的尺寸為直徑150mm、柱長250mm，其中娃球 粒徑為10-50 μ m，使用時柱溫為室溫或25-40 °C。3. 根據權利要求1所述的黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取方法，其特征在 于：所述步驟（5)中的Silica正相硅膠色譜柱的尺寸為直徑20mm、柱長250mm，其中娃球粒 徑為10-50 μ m，使用時柱溫為室溫或25-40 °C。4. 權利要求1所述的染料木素單體化合物在制備抗肺癌藥物中的應用。5. 權利要求1所述的染料木素單體化合物在制備抗肝癌藥物中的應用。
【專利摘要】本發明提供一種黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取方法：以黃綠蜜環菌子實體為原料，磨成粉末后乙酸乙酯提取，濃縮至膏狀；用正己烷-乙醇溶劑溶；一維液相色譜分離：采用Silica色譜柱，A相正己烷、B相乙醇二元流動相，B相濃度由0％至75％梯度洗脫，收集26-29min洗脫液；用乙醇-正己烷溶劑溶解；二維液相色譜分離：采用Silica色譜柱，A相正己烷、B相乙醇二元流動相，B相濃度2％等度洗脫，收集8-11min洗脫液，蒸發濃縮，得染料木素。該分離方法穩定，重復性高，制備量大，操作簡單省時，成本低，染料木素提取率高；目的物對肺癌A549細胞和肝癌Hep-G2細胞具有抑制作用，具有抗癌藥物開發潛力。
【IPC分類】A61P35/00, C07D311/36
【公開號】CN105601603
【申請號】CN201510550978
【發明人】張耀洲, 王歡歡, 龐莉, 韓朝, 李上文, 馬紅, 楊珊珊, 陸洪, 杜思邈, 蓋其靜
【申請人】天津耀宇生物技術有限公司
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2015年9月1日