[0021] 在液相色譜的溶劑選擇上，一維色譜分離、二維色譜分離以及中間提取物的溶解， 均采用正己烷、乙醇兩種溶劑混合液，可以通過改變乙醇的比例來調節有效成分的溶解能 力和流動相的洗脫能力，且整個色譜分離僅使用兩種溶劑，有利于提取溶劑的回收再利用。
[0022] 總的來說，本發明黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取方法工藝簡單，成本 低，試劑耗費量小，制備量大，穩定可控，重復性好，批次一致性較高，得到的染料木素純度 高，穩定性好，且具備較好的生物活性。通過細胞在線實時監測的方法觀測其在體外的抗腫 瘤作用，發現該染料木素單體化合物對肺癌A549細胞和肝癌Η印-G2細胞具有抑制作用，具 有抗癌藥物開發潛力，為抗癌天然藥物的開發提供了有力的依據。
【附圖說明】
[0023] 圖1所示的是本發明實施例1黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取方法的一 維高效液相色譜圖；
[0024] 圖2所示的是本發明實施例1黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取方法的二 維高效液相色譜圖；
[0025] 圖3所示的是本發明實施例1所得到的目的組分的分析型高效液相色譜圖；
[0026] 圖4所示的是本發明實施例1所得到的目的組分的MS質譜圖；
[0027] 圖5所示的是本發明實施例1所得到的目的組分的C13NMR核磁圖；
[0028] 圖6所示的是本發明實施例1所得到的目的組分的DEPT135核磁圖；
[0029] 圖7所示的是本發明實施例1所得到的目的組分的tfNMR核磁圖；
[0030] 圖8所示的是本發明實施例1所得到的目的組分的HMQC圖；
[0031] 圖9所示的是本發明實施例1所得到的目的組分的HMBC圖；
[0032] 圖10所示的是本發明實施例3黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取方法的 一維高效液相色譜圖；
[0033] 圖11所示的是本發明實施例3黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取方法的 二維高效液相色譜圖；
[0034] 圖12所示的是本發明實施例4黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取方法的 一維高效液相色譜圖；
[0035] 圖13所示的是本發明實施例4黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取方法的 二維高效液相色譜圖；
[0036] 圖14所示的是本發明實施例5中染料木素對肺癌A549細胞的抑制作用；
[0037] 圖15所示的是本發明實施例6中染料木素對肝癌Hep_G2細胞的抑制作用。
【具體實施方式】
[0038] 以下結合實施例對本發明作進一步具體描述。應該指出，以下具體說明都是例示 性的，旨在對本發明提供進一步的說明。除非另有說明，本發明使用的所有科學和技術術語 具有與本發明所屬技術領域人員通常理解的相同含義。
[0039] 實施例1 :黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取
[0040] 1.原料、材料：
[0041 ] 黃綠蜜環菌子實體采摘自青海祁連并經過鑒定。
[0042] 2.試劑：
[0043] 無水乙醇購自天津市北方天醫化學試劑廠；色譜級乙酸乙酯、正己烷購自 Honeywell 公司。
[0044] 3.儀器設備：
[0045] 超微粉碎機購自山東三清不銹鋼設備有限公司；臺式冷凍離心機購自Thermo公 司；30升中藥提取罐購自上海順儀實驗設備有限公司；恒溫鼓風干燥箱購自上海一恒科學 儀器有限公司；旋轉蒸發儀上海亞容生化儀器廠；silica正相硅膠色譜柱購自博納艾吉爾 有限公司；制備型高效液相色譜儀購自江蘇漢邦科技有限公司。
[0046] 本實施例黃綠蜜環菌中染料木素單體化合物的提取，包括以下步驟：
[0047] (1)以黃綠蜜環菌子實體為原料，室溫陰干處理后，在70°C烘干脫水，然后 在-20°C超微粉碎lmin，即得黃綠蜜環菌超微粉。
[0048] (2)取上述黃綠蜜環菌超微粉3kg，經過三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡：3kg黃綠 蜜環菌超微粉加入15L乙酸乙酯，25°C浸泡48h，浸泡結束后，20°C、4,000rpm離心30min， 分別收集上清液和殘渣，上清液通過旋轉蒸發濃縮后轉移至60°C恒溫鼓風干燥箱中干燥至 恒重。第二次乙酸乙酯浸泡：第一次的殘渣加入15L乙酸乙酯，25°C浸泡36h。（浸泡結束， 按第一次浸泡方法進行處理，其中水體乙酸乙酯上清可與第一次提取上清混合，烘干至恒 重）。第三次浸泡：第二次浸泡殘渣加入15L乙酸乙酯，25°C浸泡24h，浸泡結束，按第一次 浸泡處理方法進行處理，將三次浸泡上清合并，旋蒸濃縮后烘干至恒重。
[0049] (3)將干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇體積分數為25%的正己烷-乙醇二元混 合溶劑溶解配制成125mg/mL的溶液，溶解后過0. 45 μ m的有機濾膜，得到黃綠蜜環菌子實 體小分子提取物的一維上樣溶液。
[0050] (4)對一維上樣溶液進行一維液相色譜分離：采用的色譜柱為Silica正相硅膠色 譜柱（150mmX 250mm，硅膠粒徑10 μ m)，采用的流動相為二元混合有機相，其中A相為正己 烷，B相為乙醇，進樣量為100mL/針，流動相流速為580mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測 波長210nm ;乙醇活化色譜柱3~10倍柱體積，正己烷平衡3倍柱體積，一維上樣溶液上樣， 采用B相濃度由0%至75%進行梯度洗脫50min。得到的一維液相色譜圖如圖1所示，收 集27. 5-28. 5min洗脫液（圖中7. 5號峰）作為目的組分，減壓濃縮至膏狀，得到一維液相 組分，稱重為3. 15克。
[0051 ] (5)用乙醇體積分數為10 %的乙醇-正己烷二元混合溶劑溶解一維液相組分，溶 解至濃度為75mg/mL，溶解后過0. 45 μ m的有機濾膜，得到二維上樣溶液。
[0052] (6)對二維上樣溶液進行二維液相色譜分離：采用的色譜柱為Silica正相硅膠色 譜柱（20mmX250mm，硅膠粒徑10 μπι)，采用的流動相為二元混合有機相，其中A相為正己 烷，B相為乙醇，進樣量為1000 μ L/針，流動相流速為20mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測 波長210nm，采用的洗脫方式為等度洗脫方式：B相濃度2 %進行等度洗脫15min。得到的二 維液相色譜圖如圖2所示，有一個主峰（HMG-7. 5)為目的峰，收集9-10. 5min洗脫液（圖中 HMG-7. 5峰）作為目的組分，旋轉蒸發濃縮至干，得到淺黃色針晶，稱重為0. 064克，即為本 發明目的組分。
[0053] 實施例2 :染料木素單體化合物的確認
[0054] 1、HPLC進行純度分析：
[0055] 將實施例1得到的目的組分（圖2中HMG-7. 5峰）進行HPLC進行純度分析。經 高效液相檢測純度達到95%以上，為單一化合物，HPLC譜圖見圖3。
[0056] 2、質譜分析：
[0057] 對目的組分（圖2中HMG-7. 5峰）進行質譜分析：瀚盟生物技術（天津）有限公 司，質譜圖見圖 4。EI-MS m/z:為 271(M+H)+，269(M-H)+。
[0058] 3、核磁共振分析：
[0059] 對目的組分大豆素進行核磁共振分析：由碳譜、氫譜、COSY相關譜（如圖5-9)佐 證分析得到以下結果：
[0060] ID iNMR 譜中（DMS0-d6,400MHz)的數據結果如下：δ :8. 28(1H, s，H-2)， 6. 23(1H，d，J = 2. 1Hz，H-6)，6