多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物的制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品配料和食品加工技術領域，特別涉及一種多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物的制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]多酚化合物是植物體內一類最重要的次生代謝產物，具有較強的抗氧化作用，以及明顯的抑菌、抗癌、抗衰老和抑制膽固醇升高等功效。在食品加工及人體消化過程中，多酚能與多種化合物發生相互作用，其中蛋白質/多肽是最主要的有機化合物。
[0003]蛋白質/多肽與多酚相互作用會引起蛋白質/多肽結構的改變，進而導致其功能性質如溶解性、持水能力、黏度、凝膠作用、彈性、塑性和乳化性等的相應變化。多酚與蛋白質/多肽共價反應后，反應產物在很大程度上保持了多酚的化學性質，同時賦予蛋白質/多肽分子許多新的性能，明顯拓寬了植物多酚和蛋白質/多肽的應用領域。
[0004]碳水化合物具有良好的增稠性和持水性，可通過美拉德反應引入蛋白質/多肽從而改善蛋白質/多肽的功能特性。一般來說，蛋白質/多肽因能在油水或氣液界面上形成吸附層降低界面張力而多在膠體體系中作為乳化劑使用，碳水化合物則由于其良好的增稠性和持水性而常用做穩定劑。在食品體系中兩種生物大分子共存時，顯示出比各自單獨使用時更好的性能。
[0005]美拉德反應可以使碳水化合物分子以共價鍵連接到蛋白質/多肽分子上，主要是將蛋白質/多肽分子的ε_氨基連接到碳水化合物分子的還原端。這種生物大分子復合物對于環境條件具有較高的適應性，而且蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物在膠體體系中具有乳化和穩定的雙重作用。另外，生物大分子在共價結合條件下蛋白質/多肽分子構型趨于穩定，蛋白質/多肽變性程度以及聚集程度將會減輕。
[0006]在蛋白質/多肽和碳水化合物的美拉德反應過程中，將蛋白質/多肽-碳水化合物溶液混合后進行冷凍干燥，既保證了反應底物混合的均勻性，又增大了接觸面積;溫和的反應條件能保證美拉德反應進行到適當程度，從而確保蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物具有優越的乳化及熱穩定等功能特性。
[0007]目前尚未見將多酚、蛋白質/多肽、碳水化合物制備三者共價復合物的報道。因此，發明一種既具有良好的抗氧化性和生物活性，又具有較高熱穩定性和乳化性的多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物類生物大分子尤為重要。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于提供了一種多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物的制備方法及其應用。
[0009]為了實現上述目的，本發明采取的技術方案如下:
[0010]—種多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物的制備方法，所述方法為:以多酚、蛋白質/多肽為原料，利用堿法誘導反應，制備多酚-蛋白質/多肽共價復合物;然后再以碳水化合物和制備的多酚-蛋白質/多肽共價復合物為原料，利用美拉德反應，制備多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物。
[0011]所述的一種多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物的制備方法的具體步驟為:
[0012](I)將多酚化合物與蛋白質/多肽分別溶解于磷酸鹽緩沖液中，形成多酚溶液與蛋白質/多肽溶液;在室溫或50-60 V的水浴加熱條件下，將多酚溶液與蛋白質/多肽溶液等體積混合，形成混合溶液，并調節混合溶液的PH值為8.0-10.0;然后向反應容器中緩慢通入氧氣，反應24-48h，反應過程不斷攪拌;采用超聲透析法，除去未反應的游離多酚，最后將透析袋中剩余的混合溶液冷凍干燥，得到多酚-蛋白質/多肽共價復合物固體樣品；
[0013](2)將碳水化合物和制備的多酚-蛋白質/多肽共價復合物溶于磷酸鹽緩沖液中，形成混合溶液，冷凍干燥;將干燥后的樣品磨細，過篩后，進行美拉德反應，反應結束后采用超聲透析法除去未反應的碳水化合物，得到多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物。
[0014]所述的多酚為:茶多酚、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、綠原酸、沒食子酸、單寧、槲皮素、阿魏酸或姜黃素。
[0015]所述的蛋白質/多肽為:乳蛋白、血清蛋白、卵蛋白、魚糜蛋白、明膠、膠原蛋白、大豆蛋白、花生蛋白、乳清蛋白肽、大豆肽、玉米肽、小麥肽、膠原肽或谷胱甘肽;所述的乳蛋白為α-乳白蛋白、β_乳球蛋白、乳鐵蛋白或酪蛋白。
[0016]所述的碳水化合物為葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、聚葡萄糖、燕麥β-葡聚糖、菊粉或麥芽糊精。
[0017]所述多酚化合物的用量為0.5g/L-50g/L，蛋白質/多肽的用量為10g/L-200g/L，碳水化合物的用量為10g/L-200g/L。
[0018]所述美拉德反應的條件為:反應在固相中進行，反應的相對濕度為79%，溫度為50-100 °C，pH值為4-11，反應時間為18h-24h。
[0019]所述超聲透析法的方式為:將透析袋固定于裝有去離子水的透析容器內，在20-106KHz的超聲頻率下，透析24-72h，每隔3-6h換一次去離子水。
[0020]所述的一種多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物的制備方法制備的多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物。
[0021]所述的多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物在制備β_胡蘿卜素乳狀液中的應用。
[0022]所述應用采取的方式為:將多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物溶解于水中，形成濃度為5g/L-50g/L的水相;將β-胡蘿卜素溶解于植物油中，形成濃度為0.5g/L-10g/L的油相;然后將水相與油相按(20:1)-(10:1)的體積比混合后，在8000-1200(^/1^11的條件下剪切乳化6-10min，再進行高壓均質，得到β-胡蘿卜素乳狀液。
[0023]所述的高壓均質方式為:在溫度為45-75°C的條件下，采用二級加壓，均質1-5次；其中，一級均質壓力為30-60Mpa，二級均質壓力為3_6Mpa。
[0024]本發明的有益效果為:所述制備方法使用天然來源的多酚化合物、蛋白質/多肽和碳水化合物，不使用任何有機試劑，通過兩個步驟即可獲得性能良好的多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物，制備方法簡單、高效、安全，易于生產。所得產品具有較高的抗氧化性和乳化性，利用多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物穩定的β-胡蘿卜素乳狀液具有良好的理化穩定性。
【附圖說明】
[0025]圖1為制備多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物的流程示意圖。
[0026]圖2為乳鐵蛋白、綠原酸-乳鐵蛋白共價復合物、綠原酸-乳鐵蛋白-葡萄糖共價復合物、綠原酸-乳鐵蛋白-聚葡萄糖共價復合物累積分子量分布圖。
[0027]圖3為乳鐵蛋白、綠原酸、綠原酸-乳鐵蛋白共價復合物、綠原酸-乳鐵蛋白-葡萄糖共價復合物、綠原酸-乳鐵蛋白-聚葡萄糖共價復合物、綠原酸-乳鐵蛋白-葡萄糖非共價復合物和綠原酸-乳鐵蛋白-聚葡萄糖非共價復合物的鐵還原力圖；其中CA:綠原酸;LF:乳鐵蛋白；CA-LF con:綠原酸-乳鐵蛋白共價復合物;CA-LF-Glu con:綠原酸-乳鐵蛋白-葡萄糖共價復合物;CA-LF-Glu mix:綠原酸-乳鐵蛋白_葡萄糖非共價復合物;CA-LF-PD con:綠原酸-乳鐵蛋白-聚葡萄糖共價復合物;CA-LF-PD mix:綠原酸-乳鐵蛋白-聚葡萄糖非共價復合物。
[0028]圖4為分別采用乳鐵蛋白、綠原酸、綠原酸-乳鐵蛋白共價復合物、綠原酸-乳鐵蛋白-葡萄糖共價復合物、綠原酸-乳鐵蛋白-聚葡萄糖共價復合物、綠原酸-乳鐵蛋白-葡萄糖非共價復合物和綠原酸-乳鐵蛋白-聚葡萄糖非共價復合物制備的胡蘿卜素乳狀液的粒徑分布圖；其中CA:綠原酸;LF:乳鐵蛋白；CA-LF con:綠原酸-乳鐵蛋白共價復合物;CA-LF-Glu con:綠原酸-乳鐵蛋白-葡萄糖共價復合物;CA-LF-Glu mix:綠原酸-乳鐵蛋白-葡萄糖非共價復合物;CA-LF-PD con:綠原酸-乳鐵蛋白-聚葡萄糖共價復合物;CA-LF-PD mix:綠原酸-乳鐵蛋白-聚葡萄糖非共價復合物。
【具體實施方式】
[0029]本發明公開了一種多酚-蛋白質/多肽-碳水化合物共價復合物的制備方法及其應用，所述制備方法的流程圖如圖1所示。下面結合具體實施例對本發明做進一步闡述，但不應理解為對本發明的限制。所述原料如無特殊說明，均為能從商業途徑獲得的產品。所述測試方法均為常規方法。
[0030]實施例1:表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)-a-乳白蛋白-葡萄糖共價復合物的制備
[0031 ]將EGCG(4g/L)與α-乳白蛋白(16g/L)溶解于ρΗ8.0的磷酸鹽緩沖液中，形成EGCG溶液與α-乳白蛋白溶液;在50 0C的水浴條件下，將EGCG溶液與α-乳白蛋白溶液等體積混合，形成混合溶液，并調節混合溶液的PH值為8.0;然后向反應容器中緩慢通入氧氣(I毫升/分鐘)，反應24-48h，反應過程不斷攪拌，使EGCG氧化成醌類化合物并與α-乳白蛋白的側鏈氨基酸基團反應生成EGCG-α-乳白蛋白共價復合物;將反應后的混合溶液置于透析袋(截留分子量3500kDa)中，然后將透析袋固定于裝有去離子水的透析容器內，在50KHz的超聲頻率下，透析24h，每隔3h換一次去離子水，以確保未反應的游離EGCG完全透析出去，最后將透析袋中的剩余的混合物冷凍干燥，得到EGCG-α-乳白蛋白共價復合物固體樣品；
[0032]將葡萄糖和制備的EGCG-α-乳白蛋白共價復合物按1: 2的質量比溶于pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，形成混合溶液，冷凍干燥；將干燥后的樣品磨細，過200目篩，在相對濕度為79%，溫度為60°C，pH值為7的條件下，固相反應24h;反應結束后將共價復合物置于透析袋(截留分子量3500kD