為0. 18g/ml，隨著體 重的增加，相應的給藥體積隨體重而變化，相當于0. 56g/kg/d ;
[0099] 3實驗方法
[0100] 3. 1 曠場實驗（OFT)
[0101] 測試動物在新奇開場環境下的自發性活動和探索行為，可用于評價其興趣大小程 度。實驗前，小鼠在測試房間內先適應lh，房間內保持安靜，光照柔和。曠場箱由4塊50cm 高的白色亞克力板圍成50cm*50cm大小的正方形，底板也為白色亞克力板，正上方有一攝 像頭連接計算機軌跡跟蹤系統。每只大鼠放置于曠場中央，記錄其3min行為活動。通過計 算機軌跡跟蹤系統分析下列參數：行走總距離和站立次數（動物兩前爪同時離地次數）。行 走總距離和站立次數降低表明動物在新奇環境下興趣度下降。每測試1只動物后用酒精清 潔曠場箱底板
[0102] 3. 2 強迫游泳（FST)
[0103] 小鼠進行強迫游泳刺激：實驗時迫使小鼠在一局限的空間游泳，它們首先拼命泳 動試圖逃跑，隨后處于一種漂浮的不動狀態，僅露出鼻孔維持呼吸，四肢偶爾劃動以保持身 體不至于沉下去，這種狀態被稱為不動狀態，實際是動物放棄逃脫的希望。每次刺激從大鼠 入水到離開泳池，時間為IOmin (適應6分鐘，取樣測定4分鐘）。
[0104] 3. 3 懸尾（TST)
[0105] 懸尾（TST)是一種經典而又能快速評價抗抑郁藥物的方法。其原理是利用小鼠懸 尾后企圖逃脫但又無法逃脫，從而放棄掙扎，進入特有的抑郁不動狀態，實驗過程中記錄動 物不動時間來反映抑郁狀態，抗抑郁藥物、興奮藥物能明顯地縮短改變其狀態。
[0106] 小鼠進行進行懸尾刺激。實驗時將大鼠尾部夾住懸起，懸尾大鼠為克服不正常體 位而掙扎活動，但活動一定時間后，出現間斷性不動。表現出放棄調整的希望。每次刺激從 大鼠尾部夾住懸起到放下休息，時間為IOmin ((適應6分鐘，取樣測定4分鐘）。
[0107] 3. 4高架十字迷宮（EPM)
[0108] 高架十字迷宮是利用動物對新異環境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛 盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態。高架十字迷宮具有一對開臂和一對閉臂，嚙齒類動物 由于嗜暗性會傾向于在閉臂中活動，但出于好奇心和探究性又會在開臂中活動，在面對新 奇刺激時，動物同時產生探究的沖動與恐懼，這就造成了探究與回避的沖突行為，從而產 生焦慮心理。而抗焦慮藥物能明顯增加進入開臂的次數與時間。
[0109] 木質十字（65amX5cm)，包括3部分：兩相對開臂區（30cmX5cm)，兩相對閉臂區附 有立墻（30cmX5cmX30cm)，中央區（5cmX5cm);十字迷宮離地面50cm，實驗由25W紅燈泡 離中央區40cm高處照明；EPM將小鼠放入高架十字迷宮中央區，頭面對開臂區，用攝像系統 記錄動物5min內的行為變化，包括兩臂停留時間、進入次數；其中，4只爪子經中央區均進 入一臂方可開始記錄實驗參數。進入開放臂次數及停留時間與大鼠的焦慮情緒成負相關， 進入開放臂次數越少，停留時間越短，說明老鼠的焦慮情緒越嚴重。
[0110] 3. 5腦內神經遞質的測定
[0111] 末次行為學實驗結束后，小鼠摘眼球取血，處死后于冰浴中迅速取出小鼠腦組織， 并分離海馬，迅速置于液氮中，隨后轉移至-80°C保存，備用。
[0112] 3. 5. 1神經遞質樣品前處理方法：
[0113] 3. 5. I. 1海馬及前額葉皮質樣品的處理
[0114] 組織稱重+400 μ L 0· 1 %甲酸-甲醇+10 μ L IS (3,4-二羥基芐胺，10 μ g/mL，甲 醇溶）一勻漿一13000印111，151^11，4°(：離心一取上清，氮吹干一10(^1^初始流動相（0.1% 甲酸-水：乙腈=98:2)復溶，渦旋一13000印111，151^11，4°(：離心一小心吸取上清，1(^1^進 樣。（最終樣品濃度：組織重/100 μ L，內標濃度：1 μ g/mL)
[0115] 3· 5. I. 2血清樣品前處理方法：
[0116] 未抗凝的Ep管摘小鼠眼球取全血一13000rpm，15min，4°C離心取上清（置4°C 冰箱備用）一取IOOvL血清+IOyL IS(3,4-二羥基芐胺，10yg/mL，甲醇溶）一渦旋 -13000rpm，15min，4°C離心一取上清，氮吹干一100 μ L初始流動相（0· 1 %甲酸-水：乙 腈=98:2)復溶，禍旋一13000rpm，15min，4°C離心一小心吸取上清，10 μ L進樣。
[0117] 3. 5. L 3神經遞質測定條件
[0118] UPLC :Agilent Technologies 6410Triple Quad LC/MS，液相條件：色譜柱： Waters ACQUITY HSS T3柱（2. 1_X 100mm，1.8 μ m);流動相：梯度洗脫，流動相組成件表 1，流動相A為，流動相B為。流速：0.1 mL · min-1 ;進樣室溫度：4°C ;柱溫：35°C ;進樣量： 10. 0 μ L。質譜條件見表2,質譜參數見表3.
[0119] 表1神經遞質測定的流動相
[0123] 表3神經遞質測定的質譜參數
[0124]
[0125] 3. 6統計分析
[0126] 采用SPSS 13. 0軟件進行統計分析，實驗數據以采用單因素方差分析，組間差異 采用Dunnett ' S后檢驗，P〈0. 05表示有統計學意義。
[0127] 4實驗結果
[0128] 4. 1 曠場（OFT)實驗
[0129] 術后恢復14天，第十五天進行OFT實驗，結果表示OB模型成功，OB手術引起小鼠 在礦場活動總路程明顯增加。給藥28天后，曠場實驗（OFT)測試動物在新奇環境下的自發 性活動和探索行為，青娥方提物各組行走總距離均較模型組提高，表明青娥方提取物各組 可增加抑郁模型動物在新奇環境下興趣度。
[0130] 表4給藥28天后各組動物在曠場中活動總路程
[0132] 4. 2 懸尾實驗（FST)
[0133] 給藥28天后，懸尾實驗的結果見表5，由結果可知，青娥方提取物組可明顯縮短OB 小鼠懸尾不動時間，這表明青娥方提取物對抑郁的治療作用，小鼠懸尾后企圖逃脫，掙扎逃 脫的欲望增加。
[0134] 表5青娥方提取物對小鼠懸尾不動時間的影響
[0135]
[0136] 4. 3高架十字迷宮（EPM)
[0137] 給藥28天后，高架十字迷宮實驗的結果見表6,由結果可知，陽性藥物百憂解和文 拉法辛均能增加小鼠在開臂的停留時間，青娥方提取物能顯著增加OB小鼠進入開臂的時 間，表明青娥方提取物能增加抑郁小鼠對新異環境的探究特性，青娥方提取物對抗動物的 焦慮情緒具有很好的作用。其抗焦慮情緒作用甚至強于陽性藥物百憂解及文拉法辛。相對 開臂時間是進入開臂時間和進入閉臂時間的比值，是衡量抗焦慮作用的一個重要參數。青 娥方提取物可顯著增加OB小鼠的相對開臂時間，表明其具有較好的抗焦慮作用。
[0138] 表6青娥方提取物抗焦慮作用
[0140] 4. 4 游泳實驗（FST)
[0141] 給藥28天后，游泳實驗結果見表7,結果表明給予青娥方提取物治療后，OB小鼠強 迫游泳不動時間明顯較模型組縮短，表明青娥方提取物的抗抑郁作用明顯。
[0142] 表7青娥方提取物對抑郁小鼠強波游泳實驗不動時間的影響
[0144] 4. 5嗅球切除小鼠給予藥物治療后對海馬神經遞質的影響
[0145] 嗅球切術小鼠給予陽性藥物和青娥方提取物治療后，海馬γ -GABA水平較模型組 顯著增加（Ρ〈〇. 05)，海馬Glu水平較模型組顯著降低（ρ〈0. 05)，且Glu/GABA較模型組有顯 著降低，且青娥方提取物治療28天后，小鼠海馬Glu/GABA趨于和假手術組一致。海馬多巴 胺和NE的含量較模型組顯著增加 （p〈0. 05)，且5-HT/5-HIAA比值顯著增加 （p〈0. 05)，結果 見表8。
[0146] 表8嗅球切除小鼠給予藥物治療后對海馬神經遞質的影響
[0148] (三）結論
[0149] 海馬在解剖結構上屬于邊緣系統前腦皮質，它與下丘腦，杏仁核，腦干有著極其復 雜的相互聯系，與情緒認知密切相關，尤其是控制抑郁方面非常重要。是目前情緒應激，抑 郁癥研究涉及最多的腦區。抑郁模型大鼠存在Glu/GABA平衡的失調。青娥方提取物能夠 逆轉OB造成的Glu/GABA比值的增加，該研究結果提示青娥丸及提取物可能通過影響腦內 的Glu和GABA代謝，即主要通過Glu/GABA-Glu代謝環路循環而發揮抗抑郁作用。
[0150] 5-羥色胺屬于吲哚胺類神經遞質，不能透過血腦屏障，所以中樞的5-羥色胺是腦 內合成的。值得一提的是，5-HIAA是5-HT的代謝產物，5-HT/5-HIAA的比值的增加，說明 5-HT的代謝受到了抑制，該過程由單胺氧化酶所催化，青娥方提取物能顯著增加OB鼠海馬 5-HT/5-HIAA的比值，提示青娥方提取物可通過抑制單胺氧化酶的活性發揮抗抑郁作用。
[0151] 本實驗結果表明，青娥方提取物可增加抑郁小鼠礦場活動總路程，降低懸尾不動 時間，增加小鼠進入高架十字迷宮開臂時間，減少抑郁小鼠強迫游泳不動時間，表現出較好 的抗抑郁作用。青娥方提取物的抗抑郁的作用可能通過多條途經發揮作用，一方面，青娥方 提取物對Glu的降低作用和γ -GABA的增加作用說明青娥方提取物具有調節中樞神經系統 神經遞質Glu和γ -GABA代謝的作用，降低Glu/ γ -GABA的比值，減弱GABA能神經遞質的 傳遞，調控受體兒茶酚胺的反應性，從而發揮抗抑郁作用的。另一方面，青娥方提取物通過 抑制單胺氧化酶的活性，增加中樞神經系統5-ΗΤ的水平，發揮抗抑郁作用。該研究的結果 很好的解釋了中藥發揮藥效的多靶點多途徑的作用。
[0152] 下述實施例均能實現上述實驗例的效果。
[0153] 實施例1 :青娥方提取物1
[0154] 杜仲（鹽炒）480克，補骨脂（鹽炒）240克，核桃仁（炒）150克，大蒜120克
[0155] 按上述比例取上述藥材，8倍體積75%乙醇回流提取3次，每次提取I. 5小時，減 壓回收溶劑，得青娥