雨生紅球藻游動細胞的培養方法及原生質體的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種雨生紅球藻游動細胞的培養方法及原生質體的制備方法。
【背景技術】
[0002]雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)被公認為自然界中生產天然4下青素(3，3 ’ -二羥基-β，β ’ -類胡蘿卜素-4，4 ’ -二酮)的最好生物。蝦青素是一種生物活性物質，具有抗氧化、消除自由基、增強動物免疫、促進繁殖、生長、成熟等作用，被應用于醫藥、水產養殖等各個領域。近年來，雨生紅球藻已應用于大規模的自養培養中，但由于雨生紅球藻為自養型生物，導致其在培養過程中存在生長緩慢、生物量低、培養條件要求高等問題，嚴重制約了雨生紅球藻大規模商業化高密度培養。利用現代微生物育種技術選育性狀優良的藻株已日益受到關注。原生質體融合、基因工程等育種技術已成為選育優良藻株的有效手段。因此，建立高效的雨生紅球藻原生質體的制備技術及其重要。
[0003]雨生紅球藻的生活周期主要分為進行營養生長的綠色游動細胞時期和積累紅色蝦青素的不動細胞時期。當環境適宜(如低光照、營養鹽充足等)時，細胞為綠色細胞并且大量繁殖。當細胞處于脅迫條件(如高光照、營養鹽缺乏、高C/N等)時，細胞壁增厚、體積增大、細胞增殖減慢，且因積累大量蝦青素而呈紅色。雨生紅球藻生長十分緩慢，Harker等曾在30L的氣升式(air-lift)光反應器中用光和自養方法(不添加有機碳源)培養雨生紅球藻，三周的時間內，生物量僅達到15個/ml。
[0004]藻類的細胞操作可以追溯到50年代末期，Fushs(1958)利用絲狀藍藻一一顫藻(Oscillatoria amoena)制備得到原生質體。到70年代中后期，其他種類藻原生質體的制備也相繼獲得成功:Kobayashi用機械法擠壓出羽藻(Bryopsis hypnoides)的原生質體；1986年，Cheney分離得到江籬(Gracilaria verrucosa)的原生質體，并培養成株；1989年，周一紅和王素娟用生物技術手段分離獲得鶴聘菜(Caloglossalep rieurii)原生質體并培養成株。1990年，Saga和Sakai分離到海帶(Laminaria Japonica)、巨藻(Macrocystis)和馬尾藻(Sargassum horueri)的原生質體，并把巨藻和馬尾藻的原生質體培養成株。1993年，GalI等分離到了長紫菜(porphyra crispata)的原生質體，并觀察了其中間及最終再生形態。1996年，查向東等利用褐藻膠酶和纖維素酶獲得裙帶菜配子體原生質體，并經4-5周再生成為同普通配子體大小和形狀相同的新的配子體。
[0005]早期酶法制備原生質體過程中的酶主要來源于生物體內，如微生物來源的海藻解壁酶、動物來源的海藻解壁酶。目前，廣泛用于原生質體制備的酶主要有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、幾丁質酶、蛋白酶、崩潰酶、離析酶等。范寰等(一種白腐真菌的原生質體制備方法，中國專利200910228483X)采用蝸牛酶酶解分離一種酵母菌的原生質體，β-巰基乙醇預處理條件下，原生質體形成率可達90%-96 %。
[0006]根據不同藻類細胞壁成分的不同，各種多糖水解酶如纖維素酶、蝸牛酶、果膠酶、離析酶等被廣泛應用于微藻原生質體的制備中。魏東等(葡萄藻原生質體的制備及葡萄藻原生質體制備率檢測方法，中國專利201410312883Χ)提出采用纖維素酶、果膠酶及離析酶的復合酶溶液來制備葡萄藻原生質體的方法，但并未提及制備效率。
[0007]對于雨生紅球藻而言，其細胞壁是由糖蛋白分子以及少量的纖維素和幾丁質組成，所以Tjahjono于1993年提出以蛋白酶K來制備原生質體。隨后在2004年王明茲等(雨生紅球藻原生質體制備與再生技術，中國專利2004100075358)用酸性緩沖液、EDTA和二硫蘇糖醇配制而成的預處理劑處理雨生紅球藻細胞，然后以纖維素酶、蝸牛酶、果膠酶和酸性緩沖液組成的復合高滲酶溶液來分離得到原生質體，制備率可達80%。但是，在雨生紅球藻生活史中存在多種細胞類型，其細胞壁結構及組成均存在較大差異。上述專利中原生質體制備方法并未針對雨生紅球藻生活史中特定細胞，且需要進行破壁預處理，方法繁瑣，耗時較長，所需酶種類較多。
【發明內容】
[0008]針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種雨生紅球藻游動細胞的培養方法，以快速獲得富集化的雨生紅球藻游動細胞。
[0009]本發明的另一目的是提供一種利用雨生紅球藻游動細胞制備原生質體的方法，用以制備雨生紅球藻原生質體。
[0010]為實現上述目的，本發明采用下述技術方案:
[0011]本發明技術方案的提出，是基于發明人認為在雨生紅球藻的生活史中存在游動細胞和不動細胞兩種細胞，這兩種細胞細胞壁結構上存在很大差異，游動細胞的原生質不含有纖維素層，僅被一層透明的凝膠狀細胞層所包被，而不動細胞則存在厚而致密的纖維素化細胞壁層，因而通過游動細胞制備原生質體應要明顯優于不動細胞。
[0012]本發明的第一方面，提供一種雨生紅球藻游動細胞的培養方法，包括將雨生紅球藻在含有乙酸鈉、酵母提取物和其他無機營養的培養基中進行培養的步驟。
[0013]上述培養基中，乙酸鈉濃度為0.5-3g/L，酵母提取物濃度為0.5-3g/L;其中，乙酸鈉不僅為紅球藻提供異養的有機碳源，而且還明顯導致藻細胞光自養的光合綜合性能指數發生改變;酵母提取物為普通市售酵母提取物，含有氨基酸、核苷酸、肽、B族維生素、微量元素、各種形式的氮和磷等營養物質，可明顯促進雨生紅球藻游動細胞的快速增殖。
[0014]上述培養基中，所述其他無機營養包含:硝酸鈉1000mg/L，七水硫酸鎂75mg/L，二水氯化媽3611^凡，磷酸二氫鉀40mg/L，碳酸鈉20mg/L，梓檬酸6mg/L，梓檬酸鐵錢3mg/L，乙二胺四乙酸鈉lmg/L，七水硫酸鋅0.22mg/L，五水硫酸銅0.08mg/L，四水氯化猛1.8lmg/L，二水鉬酸鈉0.39mg/L，六水硝酸鈷0.05mg/L，硼酸2.86mg/L。
[0015]上述培養方法中，培養的條件為:培養溫度為20-25°C、光照強度為30-60ymol m—2S.1,培養時間為3-6天。
[0016]采用上述的培養方法，獲得的雨生紅球藻的游動細胞占總細胞數的85%以上，細胞密度可達15個/ml以上。
[0017]本發明的第二方面，提供一種利用游動細胞制備原生質體的方法，包括:將雨生紅球藻的游動細胞以一定初始密度重懸于含有膠原蛋白酶的緩沖液中進行酶解的步驟和制備雨生紅球藻原生質體懸液的步驟。
[0018]上述方法中，所述膠原蛋白酶選自膠原蛋白酶I，II，III或IV類型。
[0019]上述方法中，所述膠原蛋白酶的濃度為0.2-0.6%(m/v)。
[0020]上述方法中，所述酶解的條件為:在35±1°C和10rpm轉速下酶解15-60分鐘。
[0021]上述方法中，制備雨生紅球藻原生質體懸液的步驟具體為:離心收集酶解后的細胞，利用緩沖液進行洗滌，然后重懸在緩沖液中，獲得雨生紅球藻原生質體懸液。
[0022]上述方法中，緩沖液中主要成分為:0.5mM CaCl2，0.2M山梨醇/甘露醇，0.05MTris-HCKpH 7.8)。
[0023]上述方法中，游動細胞的初始密度為0.5-3X 15個/ml。
[0024]本發明的有益效果:
[0025](I)本發明提供了一種培養基成分及其培養條件，可用于快速富集培養獲得雨生紅球藻游動細胞，采用本發明的培養基和培養條件進行培養，獲得的雨生紅球藻的游動細胞占總細胞數的85%以上，細胞密度可達15個/ml以上，在短時間內實現了雨生紅球藻的大量繁殖。
[0026](2)本發明還提供了一種利用雨生紅球藻游動細胞制備原生質體的方法，通過含有膠原蛋白酶成分的酶解液，可以高效處理獲得雨生紅球藻原生質體，原生質體的得率最尚可達88 %以上。
【具體實施方式】
[0027]下面通過具體實例對本發明進行進一步的闡述，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發明，并不對其內容進行限定。
[0028]實施例1
[0029]將雨生紅球藻(SCCAP K-0084)不動細胞接種于含0.5g/L乙酸鈉和3g/L酵母提取物的8611培養基中(8611培養基中含有硝酸鈉100011^/1，七水硫酸鎂7511^/1，二水氯化鈣3